Белки́ (протеины), высокомолекулярные природные полимеры, построенные из остатков L-α-аминокислот, соединённых амидной (пептидной) связью (–CO–NH–). Первый аминокислотный остаток полимерной цепи белков называется N-концевым, последний – C-концевым. Каждый белок характеризуется специфической аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространственной структурой (конформацией). В живых организмах белки образуются в ходе трансляции на рибосомах.

Амидная связь в линейной полипептидной цепи.Амидная связь в линейной полипептидной цепи.Белки играют первостепенную роль в жизнедеятельности всех организмов. На их долю приходится не менее 50 % сухой массы органических соединений животной клетки и более 40 % в клетках растений (самое высокое содержание белков в семенах). Предполагается, что в природе существует несколько миллиардов различных белков. Только в кишечной палочке насчитывают более 3 тыс. белков. В составе генома человека идентифицировано более 30 тыс. кодирующих белки генов; к 2022 г. в рамках проекта «Протеом человека» (Human Proteome Project / HPP), инициированного Human Proteome Organization (HUPO), было идентифицировано 18 407 белков организма человека, что составляет 93,2 % от общего объёма предсказанных белковых последовательностей (The 2022 Report on the Human Proteome ... 2023).

Исторический очерк

Название «белки» впервые было дано веществу птичьих яиц, свёртывающемуся при нагревании в белую нерастворимую массу. Первые работы по выделению и изучению белковых веществ были выполнены в 18 в. Однако они носили описательный характер. В 19 в. Ж. Л. Гей-Люссак и Л. Ж. Тенар первыми осуществили аналитические исследования ряда белков и установили, что белковые вещества сходны как по внешним признакам и свойствам, так и по элементному составу. Важным событием в изучении белков явилось выделение из белкового гидролизата аминокислоты глицина (французский химик А. Браконно, 1820).

Первая концепция строения белков (теория протеина) принадлежит голландскому химику Г. Я. Мульдеру (1836). Он сформулировал понятие о минимальной структурной единице – протеине, присутствующей во всех белках, которой приписал следующий состав: 2C₈H₁₂N₂ + 5O. Позднее эта структура была уточнена (C₄₀H₆₂N₁₀O₁₂), в состав некоторых белков включены сера и фосфор.

Эта теория была повсеместно признана, но уже в 1846 г. Ю. Либих и работавший у него в лаборатории российский химик Н. Э. Лясковский высказали несогласие с определёнными её положениями, а спустя некоторое время она осталась в прошлом. Несмотря на это, труды Г. Мульдера привлекли большое внимание к аналитическим исследованиям белков, совершенствованию препаративных методов белковой химии, сделали белки главным объектом развивающейся химии природных соединений.

Постепенно формируется представление о функциях белков в живых организмах. В 1835 г. Й. Я. Берцелиус предположил, что белки играют роль биокатализаторов. Вскоре были открыты протеолитические ферменты – пепсин (1836) и трипсин (1856). На формирование современных представлений о структуре белков повлияли работы немецкого анатома и физиолога Г. Мейсснера по расщеплению белков протеолитическими ферментами.

К концу 19 в. было изучено большинство аминокислот, входящих в состав белков, и в 1894 г. А. Коссель выдвинул идею о том, что основными структурными элементами белков являются аминокислоты. В начале 20 в. значительный вклад в изучение белков внёс Э. Фишер, который, используя методы органической химии, доказал, что белки построены из α-аминокислот, связанных амидной связью. Он же сделал первые аминокислотные анализы белков, дал правильное объяснение протеолизу.

В первой половине 20 в. получили развитие физико-химические методы анализа белков, определены молекулярные массы многих из них, получены данные о сферической форме глобулярных белков (Т. Сведберг, 1926). Был выделен белковый гормон – инсулин (Ф. Бантинг, Ч. Г. Бест, 1922), получены первые кристаллические ферменты (Дж. Б. Самнер, 1926; Дж. Г. Нортроп, 1929), доказана белковая природа антител (1939), разработаны методы хроматографического анализа белков (А. Мартин, Р. Синг, 1944). В начале 1950-х гг. была высказана идея о трёх уровнях организации белковых молекул (датский биохимик К. У. Линнерстрём-Ланг, 1952), которая позднее нашла подтверждение.

Развитие аналитических методов привело к созданию автоматического аминокислотного анализатора (С. Мур, У. Стайн, 1958), существенной модификации хроматографических методов и совершенствованию рентгеноструктурного анализа; был создан секвенатор – прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в белках (П. Эдман, Дж. Бегг, 1967). В эти годы была определена структура нескольких сотен белков. Разработка эффективного метода анализа нуклеотидной последовательности ДНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сенгер) существенно облегчила определение последовательностей аминокислот в белках исходя из данных о структуре кодирующих их генов. Это позволило устанавливать структуру белков, доступных в ничтожно малых количествах (например, интерферон), а также белков, обладающих большой молекулярной массой (содержащих 700 и более аминокислотных остатков).

Успехи структурного анализа позволили приступить к определению пространственной организации и молекулярных механизмов функционирования надмолекулярных комплексов, в том числе рибосом и вирусов. В конце 20 в. появилась новая область исследования белков – протеомика, в задачу которой входит комплексный анализ совокупности белков отдельных клеток, органов и систем, функционирующих в данный конкретный момент времени в норме и при патологии.

Биологическое значение

Белки выполняют многочисленные функции. Обмен веществ (пищеварение, дыхание, выделение и др.) и жизнь клетки в целом неразрывно связаны с активностью ферментов – высокоспецифических катализаторов биохимических реакций, являющихся белками. Защитные системы высших организмов формируются защитными белками, к которым относятся иммуноглобулины, белки комплемента, цитокины иммунной системы, белки системы свёртывания крови (в том числе плазмин, тромбин, фибрин). Важную группу составляют регуляторные белки, контролирующие биосинтез белков и нуклеиновых кислот. К их числу относятся также пептидно-белковые гормоны.

Информация о состоянии внешней среды, различные регуляторные сигналы воспринимаются клеткой с помощью рецепторных белков, располагающихся на наружной поверхности плазматической мембраны. За передачу сигналов внутрь клетки ответственны белки сигнальных систем (G-белки, белки-эффекторы), которые играют важную роль в передаче нервного возбуждения и в ориентированном движении клетки (хемотаксис).

В активном транспорте ионов, липидов, сахаров и аминокислот через биологические мембраны участвуют транспортные белки, или белки-переносчики. Среди них, например, гемоглобин и миоглобин, осуществляющие перенос кислорода. Основу костной и соединительной тканей, шерсти, роговых образований составляют структурные белки (в том числе коллаген, кератин, эластин). Они же формируют клеточный скелет и межклеточный матрикс. Расхождение хромосом при делении клетки, движение жгутиков, работа мышц животных и человека осуществляются по единому механизму при посредстве белков сократительной системы (актина, миозина, тропомиозина, тубулина и др.).

Белки – важнейшая составная часть пищи человека и кормов животных. Особое значение при этом имеют запасные белки растений и животных (например, казеин, проламины). Преобразование и утилизация энергии, поступающей в организм с пищей, а также энергии солнечного излучения происходят при участии белков биоэнергетической системы (например, родопсина, цитохромов). Среди пептидно-белковых веществ имеются антибиотики (в том числе грамицидины, полимиксины, энниатины), токсины и другие биологически активные вещества.

Классификация

Белки делят на простые, состоящие только из аминокислотных остатков, и сложные. Последние могут включать ионы металла (металлопротеины) или пигменты (хромопротеины), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеины), а также ковалентно связывать остаток фосфорной кислоты (фосфопротеины), углевода (гликопротеины) или нуклеиновой кислоты (геномы некоторых вирусов).

В соответствии с формой молекул белки подразделяют на глобулярные и фибриллярные. Молекулы первых свёрнуты в компактные глобулы сферической или эллипсоидной формы, молекулы вторых образуют длинные волокна (фибриллы) и высоко асимметричны. Большинство глобулярных белков, в отличие от фибриллярных, растворимы в воде. Особую группу составляют интегральные мембранные белки, характеризующиеся неравномерным распределением гидрофильных и гидрофобных (липофильных) участков в молекуле: часть их полипептидной цепи, погружённая в мембрану, состоит в основном из гидрофобных аминокислотных остатков, а выступающая из мембраны – из гидрофильных.

Структура белков

Практически все белки построены из 20 L-α-аминокислот, которые соединены между собой пептидной связью, образованной карбоксильной и α-аминогруппой соседних аминокислотных остатков.

Белковая молекула может состоять из одной или нескольких полипептидных цепей (субъединиц), содержащих от 50 до нескольких сотен (иногда более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулярная масса белков от 5 тыс. до нескольких миллионов. Молекулы, содержащие менее 50 остатков, обычно относят к пептидам. В состав многих белков входят остатки цистина, дисульфидные связи которых ковалентно связывают участки одной или нескольких цепей.

Первичная структура инсулина человека.Первичная структура инсулина человека.Различают четыре уровня организации белковых молекул. Последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи называют первичной структурой. Все белки различаются по первичной структуре, и потенциально возможное их число практически неограниченно. Генетическая информация о первичной структуре белка заключена в его гене, который представляет собой последовательность нуклеотидов в молекулах ДНК или РНК. Каждой аминокислоте соответствует триплет (смысловой кодон) нуклеотидов, однозначно определяющий в процессе биосинтеза белка её местоположение в полипептидной цепи. Часто после синтеза белок подвергается дополнительным химическим превращениям – посттрансляционным модификациям. Вся информация, необходимая для формирования структур более высоких уровней, заложена в первичной структуре. Она содержит также некоторые участки, выполняющие самостоятельную роль в функционировании белков. Так, аминокислотные последовательности секретируемых белков включают богатый гидрофобными аминокислотами сигнальный пептид (примерно 20–30 остатков), который обеспечивает перенос белка через мембрану, после чего отщепляется.

Вторичная структура – способ пространственной укладки участков полипептидной цепи (без учёта ориентации боковых групп). Для белков особенно характерны периодические (канонические) элементы вторичной структуры: правая α-спираль и β-структура, стабилизированные водородными связями между CO- и NH-группами пептидной цепи. Модель α-спиральной конформации полипептидной цепи.Модель α-спиральной конформации полипептидной цепи.Первая характеризуется планарностью пептидной группы; на 1 виток α-спирали приходится 3,6 остатка аминокислот, шаг спирали P – 0,544 нм. Иногда в белках встречаются правые спирали, содержащие 3 аминокислотных остатка на 1 виток. Эти спирали гораздо менее энергетически выгодны, чем α-спирали; они представлены короткими участками, которые обычно располагаются на концах α-спиралей. В случае β-структуры, или структуры складчатого листа, полипептидные цепи растянуты, уложены параллельно друг другу и связаны между собой водородными связями. Остов цепи не лежит в одной плоскости, а вследствие небольших изгибов при α-углеродных атомах образует слегка волнистый слой. Боковые группы располагаются перпендикулярно плоскости слоя. Для белков характерны два вида β-структуры: с параллельным и антипараллельным направлением цепей. Частный случай β-структуры – β-изгиб, обеспечивающий поворот пептидной цепи на угол около 180° на протяжении отрезка, содержащего 4 аминокислотных остатка: 1-й и 4-й остатки соединены водородной связью.

Модель антипараллельной β-структуры.Модель антипараллельной β-структуры.Относительное содержание α-спиральных участков и β-структур в разных белках может широко варьировать. Существуют белки с преобладанием α-спиралей (около 75 % всех аминокислотных остатков в миоглобине и гемоглобине), тогда как основным типом структуры многих фибриллярных белков (например, фибрина и кератина) является β-структура. У многих белков содержание α- и β-структурных участков незначительно. Фрагменты полипептидных цепей, не образующие каноническую вторичную структуру, укладываются в пространстве строго определённым, характерным для каждого белка образом, и, следовательно, им свойственна специфическая вторичная структура. Будучи основана на ближних взаимодействиях, она в значительной мере определяется аминокислотной последовательностью соответствующего фрагмента белка, что делает возможным её теоретическое предсказание с определённой степенью вероятности. Однако на её формирование могут существенно влиять дальние взаимодействия. Так, β-структура может объединять несколько расположенных параллельно или антипараллельно отрезков, переставая быть локальным образованием и превращаясь в протяжённую супервторичную структуру. В α-кератине три α-спирали закручиваются относительно друг друга, образуя супер-α-спираль. Часто участки супервторичной структуры объединяют как α-спиральные участки, так и участки β-структуры, образуя структуры типа βαβ (например, в аминопептидазах), αβαβ (в амилазах), βαβαβαββ (в кетоацилтиолазах) и т. п.

Под третичной структурой белков понимают расположение в пространстве всех атомов белковой молекулы. При этом не учитывают её взаимодействия с соседними молекулами. Третичная структура формируется самопроизвольно и стабилизируется системой нековалентных взаимодействий – водородными, ионными, ион-дипольными, диполь-дипольными, вандерваальсовыми связями, а также гидрофобными взаимодействиями между боковыми цепями неполярных аминокислотных остатков. Как правило, внутри глобулы глобулярных белков расположены боковые цепи гидрофобных аминокислот, собранные в ядро, а полярные группировки располагаются на её поверхности в гидратированном состоянии. Однако связывание белков с другими молекулами, например фермента с его субстратом или коферментом, почти всегда осуществляется с помощью небольшого гидрофобного участка, расположенного либо на поверхности, либо в специальной впадине или щели глобулы.

Третичная структура белка соответствует его первичной структуре. Однако один и тот же способ укладки цепи в пространстве соответствует целому семейству первичных структур эволюционно родственных белков, в которых совпадать может всего лишь 20–30 % аминокислотных остатков. Эти неизменяемые (консервативные) остатки определяют положение точек изгиба полипептидной цепи, а также другие существенно важные особенности конформации, и в частности активные центры ферментов, зоны связывания других биологических молекул, эффекторные центры белков и т. д. Нарушение третичной структуры белков (денатурация) неизменно приводит к утрате их функции. Третичная структура многих белков формируется из нескольких компактных, независимо образованных областей – доменов, которые могут обладать и функциональной автономией, будучи ответственными за те или иные виды биологической активности. Между собой домены обычно связаны «тонкими перемычками» – вытянутыми участками полипептидной цепи. Пептидные связи в этих участках при обработке протеолитическими ферментами расщепляются в первую очередь, тогда как отдельные домены обычно относительно устойчивы к протеолизу. Факторы, стабилизирующие третичную структуру белков, почти компенсированы факторами, противодействующими свёртыванию полипептидной цепи в компактную глобулу, поэтому пространственная структура белков, как правило, лабильна. Третичная структура подвижна: отдельные участки молекулы белка, в особенности петли и домены, могут смещаться, что приводит к конформационным переходам, которые играют значительную роль во взаимодействии белков с другими молекулами, облегчая образование комплементарных поверхностей.

Схематическое изображение пространственной организации белка.Схематическое изображение пространственной организации белка.Четвертичная структура – пространственный ансамбль нескольких (чаще всего 2–6) взаимодействующих между собой субъединиц, представленных отдельными полипептидными цепями белка. Такой уровень организации характерен для многих белков. Между собой отдельные субъединицы соединены водородными и ионными связями, гидрофобными взаимодействиями и др. Изменение pH и ионной силы раствора, повышение температуры или обработка детергентами обычно приводит к диссоциации макромолекул на субъединицы. В большинстве случаев этот процесс обратим: при устранении факторов, вызывающих диссоциацию, происходит самопроизвольная реконструкция исходной четвертичной структуры. Некоторые белки способны образовывать структуры более высоких порядков, например полиферментные комплексы, протяжённые структуры (белки оболочек бактериофагов) и т. п. Основная функция четвертичной структуры состоит в том, чтобы относительно слабые зоны межсубъединичных контактов, легко реагирующих на изменения третичной структуры субъединиц или на присоединение тех или иных веществ-эффекторов, способны были передавать эти изменения на другие субъединицы. На этом основана кооперативность действия многих белков, регуляция их активности за счёт взаимодействий с веществами, не имеющими структурного сходства с субстратом данного белка. Так, конечный продукт, образующийся в цепи ферментативных реакций, может управлять активностью первого её звена, что позволяет приостановить затрату исходных соединений, если накопилось достаточное количество конечного продукта. Примером функционирования четвертичной структуры могут служить гемоглобины, в которых поочерёдно протекают реакции присоединения и отщепления кислорода, в зависимости от его концентрации в крови и наличия таких эффекторов, как H⁺, CO₂, Сl^– или фосфоглицерат.

Методы исследования структуры белков

Для определения первичной структуры белка прежде всего разделяют его полипептидные цепи, затем определяют аминокислотный состав цепей, N- и C-концевые аминокислотные остатки и последовательность аминокислот. Полипептидные цепи подвергают специфическому расщеплению протеолитическими ферментами (например, трипсином, который гидролизует связи по остаткам лизина и аргинина, или протеазой золотистого стафилококка, гидролизующей связи по остаткам глутаминовой кислоты) или химическими реагентами (например, бромцианом, расщепляющим связи, образованные остатками метионина, гидроксиламином – между остатками аспарагина и глицина). Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотную последовательность. Основным методом исследования аминокислотной последовательности пептидов и белков является их деградация с помощью фенилизотиоцианата (метод Эдмана); при этом происходит последовательное отщепление N-концевых аминокислотных остатков в виде фенилтиогидантоинов, которые поглощают свет в УФ-области с максимумом поглощения 265–270 нм. С помощью специального прибора – секвенатора – удаётся осуществить автоматическое отщепление и идентификацию фенилтиогидантоинов. Для этих же целей применяют масс-спектрометрию. В последние годы для установления первичной структуры белков в основном пользуются данными о последовательности нуклеотидов в их структурных генах. Для определения содержания канонических элементов вторичной структуры в белках используют методы кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения. О пространственном расположении атомов в молекуле белка судят на основании рентгеноструктурного анализа его кристаллов. С помощью дифференциальной спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния и флуоресценции изучают изменение конформации белка в процессе функционирования или при изменении внешних условий. Прямую информацию о пространственном строении белка в растворе даёт метод ядерно-магнитного резонанса.

Физико-химические свойства

Молекулы белка имеют массу от нескольких тысяч до 1 млн и выше. Константа седиментации варьирует от 1 до 20 и более. Средний удельный объём белковых молекул 0,70–0,75 см³/г. Молекулы белка обладают слабой способностью к диффузии и не проходят через полупроницаемые мембраны. Максимум поглощения белков в УФ-области спектра, обусловленный наличием в их молекулах ароматических аминокислотных остатков, находится вблизи 280 нм. В ИК-области спектра белки поглощают за счёт COO- и NH-групп при 1600 и 3100–3300 см^–1. Растворимые белки – гидрофильные коллоиды, активно связывающие воду. Белки – амфотерные электролиты, т. к. имеют свободные карбоксильные и аминные группы. Изоэлектрические точки у разных белков колеблются от менее 1,0 (у пепсина) до 10,6 (у цитохрома c) и выше. Растворимость белков также может существенно различаться. Одни белки легко растворяются в воде, другим для растворения требуется наличие небольших концентраций солей, третьи переходят в раствор только под действием сильных щелочей или детергентов. Разные белки неодинаково осаждаются из растворов органическими веществами (например, спиртами) или высокими концентрациями солей (высаливаются). Существенные различия в растворимости и другие особенности используются при выделении индивидуальных белков. Белки дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определённых аминокислотных остатков или химических группировок. К важнейшим из них относятся биуретовая (реакция с биуретом, на пептидную связь) и нингидриновая (с нингидрином, на аминогруппу) реакции. Боковые группы аминокислотных остатков способны вступать во многие химические реакции. При этом реакционная способность одних и тех же группировок существенным образом зависит от положения в полипептидной цепи белка: как от локализации группировки в общей пространственной структуре белка, так и от влияния соседних боковых групп. Наивысшей реакционной способностью обычно обладают группировки, расположенные в составе активного центра белка.

Получение белков

Разработаны методы выделения индивидуальных белков, основанные главным образом на хроматографии, включая аффинную, эксклюзионную, ионообменную и гидрофобную. Особенно продуктивно их применение в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии. Широко используются также ультрафильтрация, электрофорез и др. Критериями чистоты белков являются гомогенность при электрофорезе, хроматографии и ультрацентрифугировании. У белка, состоящего из одной полипептидной цепи, она устанавливается при анализе N-концевой аминокислоты.

Для получения пептидов, в том числе гормонов и их разнообразных аналогов, а также пептидов, несущих антигенные детерминанты различных белков и используемых для приготовления соответствующих вакцин, широко применяется химический синтез. Осуществлён химический синтез некоторых небольших белков, однако эта очень трудоёмкая процедура до сих пор имеет скорее теоретическое, чем практическое значение. Белки, имеющие промышленное значение (ферменты, гормоны, цитокины, интерфероны), синтезируются с помощью технологии рекомбинантных ДНК (генетической инженерии) в чужеродных организмах и являются продуктами биотехнологических производств. Методы белковой инженерии позволяют целенаправленно изменять структуру белков.