Культура клеток
Культу́ра кле́ток, клетки многоклеточных организмов, сохранившие способность к клеточному делению (митозу) и поддерживающие жизнедеятельность (метаболизм) вне организма в искусственных условиях.
Клеточные культуры классифицируют по продолжительности культивирования на переживающие и растущие, по способу культивирования на суспензионные и монослойные, по количеству пассажей и морфологии на первичные, диплоидные и перевиваемые и по количеству культивируемых клеточных слоёв на двумерные и трёхмерные, которые в свою очередь делятся на органные, органотипические и гистотипические клеточные культуры.
История развития культур клеток
В 1885 г. немецкий зоолог В. Ру сообщил о первом эксперименте с клеточной культурой. В ходе эксперимента он смог поддерживать жизнь куриных эмбриональных клеток в течение нескольких дней в физиологическом растворе. В 1903 г. российский учёный И. П. Скворцов выделил эксплант кожи лягушки. Клеточные культуры стали широко использоваться в науке в начале 20 в. для изучения роста и развития тканей, биологии вирусов и разработки вакцин. В 1936 г. А. Сейбин и П. Олицкий из Университета Рокфеллера успешно вырастили полиовирус в культуре ткани мозга человеческого эмбриона. В России доступен ряд вакцин, разработанных с использованием пермиссивной клеточной линии Vero (почка африканской зелёной обезьяны), например, вакцина против ротавирусной инфекции и против полиомиелита. Клеточные культуры имеют множество преимуществ по сравнению с другими живыми системами: простота заражения вирусом клеточной культуры, отсутствие факторов противовирусного иммунитета, возможность непрерывно наблюдать за клеточными культурами и по необходимости вмешиваться в происходящие процессы.
Классификация клеточных культур
По продолжительности культивирования клеточные культуры делят на переживающие и растущие. Переживающие – короткоживущие клеточные культуры, утратившие способность к митозу. Растущие культуры способны к митозу.
По способу культивирования клеточные культуры делят на суспензионные и монослойные (однослойные).
Первичная монослойная клеточная культура нейронов мыши в поле зрения флуорисцентного светового микроскопа. Фото: Дарья Климова. Суспензионные клетки растут в виде отдельных свободно плавающих клеток или небольших групп, например, культуры YAC-1 (мышиная лимфома), HL-60 (человеческая лейкемия). Монослойные клеточные культуры прикрепляются к субстрату, например, культуры Vero, SH-SY5Y (человеческая нейробластома). Предпочтительный способ культивирования для клеточной линии зависит от ткани, из которой она была получена, например, линии клеток, полученные из крови (лейкоз, лимфома), растут в суспензии, тогда как клетки, полученные из твёрдых тканей (лёгкие, почки), чаще всего растут в виде монослоя. Монослойные клеточные линии могут быть классифицированы как эндотелиальные, например, такие как BAE-1 (эндотелий аорты крупного рогатого скота), эпителиальные, например, HeLa (раковая опухоль шейки матки человека), нейрональные, в том числе SH-SY5Y, или фибробласты, такие как MRC-5 (клетки лёгких плода человека).
В некоторых случаях клеточные культуры могут расти как смешанная популяция прикреплённых и суспензионных клеток (полуслипшиеся колонии), например, B95-8 (линия В-лимфобластоидных клеток мартышки).
Монослойные клеточные культуры делят на первичные, диплоидные и перевиваемые. Первичные культуры получают из тканей и органов животных и растений с помощью ферментативного расщепления, т. е. разрушения межклеточных связей с помощью специальных веществ, ферментов. 
Перевиваемая монослойная эпителиальная клеточная культура легких человека A549 в фазе дегенерации и гибели в поле зрения светового микроскопа.
Фото: Дарья Климова.Такие культуры изначально неоднородны, но при долгом культивировании в них начинают преобладать фибробласты. Приготовление первичных культур является трудоёмким процессом, их можно поддерживать in vitro только в течение ограниченного периода времени. Первичные клетки сохраняют многие дифференцированные характеристики клетки in vivo, т. е. практически не отличаются от клеток изначального организма. Чтобы продлить жизнь культуры клеток, следует отобрать небольшое количество клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде, в среде, насыщенной питательными веществами, т. е. совершить пассирование. Номер пассажа, единичный процесс пересевания клеток, указывает на то, сколько раз клеточная линия была пересажена с одной лабораторной посуды на другую с заменой среды. Информация о возрасте клеточной культуры in vitro требуется для клеточных линий с конечной продолжительностью жизни или нестабильными характеристиками, которые меняются с течением времени при непрерывном культивировании. Первичные культуры по определению не были пассированы. Как только их пересаживают, они становятся перевиваемой клеточной линией и больше не являются первичными.
Перевиваемая суспензионная культура клеток множественной миеломы человека RPMI 8226 в поле зрения светового микроскопа. Фото: Дарья Климова.
Перевиваемая клеточная культура получена в ходе культивирования первичных клеток. Она состоит из одного типа клеток, которые могут быть последовательно размножены несколько раз (около тридцати раз). После ограниченного количества пассажей они теряют свои изначальные свойства, мутируют и умирают. Клеточные линии с ограниченным сроком жизни диплоидны. Также существуют перевиваемые клеточные линии, которые можно размножать бесконечно долго, обычно они появляются в ходе трансформации в опухолевые клетки. Линии опухолевых клеток часто получают из опухолей пациентов, но трансформация также может быть вызвана онкогенными вирусами или химической обработкой. Трансформированные клеточные линии сохраняют очень мало исходных характеристик in vivo.
Трёхмерные клеточные культуры
Кроме клеточных культур существуют органные, органотипические и гистотипические клеточные культуры. В 1957 г. А. Москона показал, что несколько типов диссоциированных клеток, культивируемые вместе, создают агрегаты – трёхмерные структуры. Органные культуры клеток представляют собой трёхмерную культуру, которая сохраняет полностью или частично все особенности ткани in vivo. Органотипические культуры клеток получают путём сокультивировирования клеток различных по происхождению. Клетки гистотипической культуры, в отличие от монослойных, могут нарастать несколькими слоями клеток с формированием трёхмерной структуры.
Питательные среды для клеточных культур
Культивируемые клетки требуют стерильной среды и источника питательных веществ для роста. Культуральная среда (питательная среда) должна быть стабильной с точки зрения pH и температуры. Первоначально, сбалансированные солевые растворы использовались для поддержания сократительной способности сердечной ткани млекопитающих, а солевой раствор Тирода был разработан для использования в работе с первичными клетками млекопитающих. С тех пор питательные среды были модифицированы и обогащены.
По своему составу питательные среды для клеточных культур делятся на простые, сложные и содержащие дополнительные компоненты. В состав простых сред входят физиологические растворы, незаменимые аминокислоты (АМК) и витамины, например, среда Игла. В состав сложных сред ходят соли BSS (сбалансированного солевого раствора), незаменимые и заменимые АМК, витамины в бόльших количествах, чем в простых, например, среда 199. К дополнительным компонентам относятся гормоны.
Жизненный цикл клеточных культур
Жизненный цикл клеточных культур состоит из трёх повторяющихся этапов: фазы адаптации, логарифмического роста и стационарной фазы. В ходе этапа адаптации клетки оседают и прикрепляются к субстрату, перемещаются по нему и готовятся к началу клеточного цикла (митозу). Как только дезагрегированные клетки попадают в питательную среду, начинает формироваться внеклеточный матрикс, а также происходит взаимодействие между рецепторами клеток и субстратом. На этом этапе клетки не делятся. В течение этого периода клетки адаптируются к условиям культивирования, и продолжительность этой фазы будет зависит от плотности посева.
В ходе логарифмического роста клетки вступают в клеточный цикл, их количество увеличивается, свободное место на субстрате уменьшается. Между клетками формируются связи, которые замедляют клеточный цикл, этот процесс называется контактным ингибированием. Контактное ингибирование требуется клеткам для сохранения баланса между свободным субстратом и питательными веществами в среде и количеством клеток. Клетки активно размножаются, и возникает экспоненциальное увеличение количества клеток. На этом этапе популяция клеток считается наиболее жизнеспособной. Во время фазы логарифмического роста чаще всего ставят эксперименты на клеточной культуре. Клетки также обычно пассируют, то есть пересаживают, на поздней стадии логарифмического роста. Результатом этой фазы является монослой.
В стационарной фазе происходит поддержание жизнедеятельности клеток и сохранения монослоя. Клеточная пролиферация замедляется из-за того, что на субстрате больше не остается свободного места. На этой стадии количество клеток в активном клеточном цикле падает до 0–10% и клетки наиболее подвержены травмам от физических, химических и биологических агентов. Например, между клетками в стационарной фазе быстрее разрушаются связи под действием ферментов, чем во время логарифмической фазы и фазы адаптации.
Дегенерация и гибель клеток происходит из-за насыщения питательной среды продуктами метаболизма, изменения pH среды и клеточного голода. Межклеточные и клеточные субстратные связи разрушаются, клетки отходят от субстрата и разрушаются – происходит лизис клеток. Окончательным этапом дегенерации и гибели клеток является фаза упадка. В ходе этой фазы преобладает гибель клеток, и количество жизнеспособных клеток уменьшается. Гибель клеток происходит из-за естественного пути клеточного цикла.
Пассирование клеточных культур
Пассирование клеток также называется субкультивированием или пересаживанием клеток в лабораторных условиях. Оно означает процесс переноса клеток с одной лабораторной посуды на другую с заменой среды. Суспензионные клеточные линии подсчитывают на основе объёма, поэтому плотность пассирования рассчитывают как клетки/мл, тогда как адгезивные клеточные линии высевают на основе площади поверхности сосуда, поэтому рассчитывают как клетки/см2.
Когда клеточная культура занимает примерно 80% объема или 80% поверхности сосуда покрыто монослоем, а сами клетки находятся в логарифмической фазе роста, требуется пересев. Культивирование клеток до большей концентрации может негативно повлиять на экспрессию генов и жизнеспособность клеток.
Все растворы и инструменты, контактирующие с клетками, должны быть стерильными, а сам процесс пересевания производится в ламинарном боксе, специальном стерильном оборудовании с направленным потоком воздуха. Для пересевания клеток требуется новая среда и реагент для диссоциации, которые предварительно должны быть нагреты до температуры 37 °C. Первым шагом в субкультивировании адгезивных клеток является удаление отработанной среды из сосуда для культивирования и промывания клеток от остатков среды. Далее следует их отделение от поверхности сосуда с помощью ферментативных средств, например, трипсина, или механических средств, например, специального скребка для клеток.
Перевиваемая монослойная клеточная линия эпителия молочной железы человека HBL 100 при подсчете в камере Горяева в поле зрения светового микроскопа. Фото: Дарья Климова.
Когда все клетки отделены, реагент диссоциации нейтрализуют с помощью ростовой среды. Клетки подсчитываются в камере Горяева или с помощью гемацитометра.
Далее клеточная суспензия разбавляется до плотности посева, оптимальной для клеточной линии, и соответствующий объём переносится в новые сосуды для культивирования и инкубируется. Так как суспензионные клетки не прикреплены к сосуду, отделять их от сосуда для культивирования не требуется, но важным этапом для их пересевания является центрифугирование с целью удаления отработанной среды.
Смена среды без пересаживания клеток также играет важную роль в культивировании. Если культура росла в течение нескольких дней, но ещё не образовала монослой, требуется смена среды для пополнения питательных веществ и поддержания правильного pH.
Использование клеточных культур
С конца 20 в. клеточные культуры используются не только в вирусологии, но и в других областях экспериментальной биологии. В онкологии клеточные культуры используются для изучения путей развития первичной опухоли и разработки лекарств. В иммунологии клеточные культуры используются для создания моноклональных антител. В фармакологии – в технологии генной инженерии для получения клеток с рекомбинантными ДНК (с заданным геномом), что позволяет синтезировать определённые клеточные продукты (инсулин и интерферон); и в исследованиях на токсичность синтезированных лекарственных препаратов (используется в качестве доклинических испытаний). В неврологии – для культивирования эмбрионов стволовых клеток, которые можно дифференцировать в нейроны. В генетике – для анализа генетического материала клеток животных. В гинекологии – для исследования генетических нарушений у плода, а также в ходе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). В трансплантационной хирургии эпидермальные клеточные линии используются для трансплантации in vivo. В тканевой инженерии – в качестве имплантата клеток плода/донора. В растительной биотехнологии и растениеводстве – как модель для исследования фундаментальных аспектов физиологии растительных клеток, а также для сохранения исчезающих видов и в метаболической инженерии химикатов. Экспериментальные применения культивируемых клеток столь же разнообразны, как и типы клеток, которые можно выращивать in vitro.