Парамиксовирусы

Парамиксови́русы (Paramyxoviridae), семейство вирусов порядка Mononegavirales. Многие представители данного семейства являются опаснейшими патогенами для человека. Наиболее изучены: вирусы парагриппа I–IV типов (ВП I–IV типа), вирус кори, вирус эпидемического паротита, высокопатогенные зоонозные вирусы Хендра и Нипах.

Структура вируса и строение генома

Парамиксовирусы относятся к оболочечным РНК-содержащим вирусам. Вирионы, как правило, сферической формы (реже – плеоморфной), размер которых варьирует от 150 до 300 нм в диаметре. К структурным элементам, свойственным всем представителям данного семейства, относят нуклеокапсид, содержащий геномную РНК, матриксный белок, формирующий оболочку вируса, и мембранные гликопротеины, обеспечивающие проникновение вируса в клетку. Нуклеокапсид парамиксовирусов имеет спиральный тип симметрии, который обеспечивает максимальное взаимодействие между нуклеиновой кислотой и белковыми субъединицами.

Геном представлен линейной несегментированной молекулой РНК отрицательной полярности, длина которой у различных представителей данного семейства варьирует от 15 до 19 кб. Геном содержит 6 генов (7 генов у некоторых представителей рода Rubulavirus), которые кодируют белки, вовлечённые в ключевые процессы жизненного цикла вируса. На 3’-конце геномной РНК располагается лидерная последовательность (длиной около 50 нуклеотидов), а на 5’-конце – трейлерная последовательность (длиной 50–161 нуклеотид). Лидерная и трейлерная последовательности необходимы для транскрипции и репликации вирусного генома.

Вирусная РНК покрыта белком нуклеокапсида (N/NP) и ассоциированным с ним комплексом из L- и P-белков, представляющих собой 2 субъединицы комплекса вирусной РНК-полимеразы. Установлено, что именно L-субъединица полимеразного комплекса обладает каталитической активностью. Примечательной особенностью гена Р большинства парамиксовирусов является наличие двух открытых рамок считывания, находящихся на расстоянии нескольких нуклеотидов друг от друга. При этом трансляция с первой рамки считывания приводит к синтезу Р-белка (фосфопротеин), а со второй – к продукту, который получил название «С-белок». Последовательность С-белка высококонсервативна; С-белок является неструктурным, считается, что он принимает участие в блокировании интерферонового ответа.

Кроме того, в последовательностях гена Р парамиксовирусов содержатся сайты редактирования (консервативные пиримидин-богатые последовательности), благодаря которым могут появляться дополнительные транскрипты (мРНК), при трансляции которых появляются неструктурные вирусные белки, не входящие в состав вирусной частицы, но участвующие в подавлении клеточных противовирусных механизмов. Комплекс из белков L, P и NP, взаимодействующих с вирусной РНК, формирует активный рибонуклеокапсид, обладающий способностью транскрибировать и реплицировать вирусный геном в инфицированной клетке. Каждая субъединица NP-белка эффективно связывается с 6 нуклеотидами РНК. При этом вирусная РНК оказывается настолько плотно упакованной в спиральный нуклеокапсид, что не подвергается действию экзогенно добавленных РНКаз. Анализ последовательностей гена нуклеокапсида показал, что 80 % N-концевой области высококонсервативны, в то время как С-конец представляет собой достаточно вариабельную область. Установлено, что консервативный N-конец белка нуклеокапсида содержит РНК-связывающий домен, а также участки, ответственные за NP-NP- взаимодействия, обеспечивающие спиральную структуру нуклеокапсида. Считается, что вариабельный С-конец NP-белка ответственен за взаимодействие с Р-белком полимеразного комплекса и матриксным М-белком.

Поверхностные антигены, встроенные в липидную оболочку вируса, можно разделить на два типа: один отвечает за связывание с рецептором на поверхности клетки (выделяют гемагглютинин (H)/гемагглютинин-нейраминидазу (NH)/гликопротеин (G)), другой – за слияние клеточной и вирусной мембран (F-белок). Для большинства парамиксовирусов взаимодействие оболочечных гликопротеинов с рецепторами на клеточной поверхности является необходимым условием для того, чтобы связаться с инфицируемой клеткой и запустить процесс слияния мембран. В основе классификации белков, за счёт которых происходит адсорбция вируса на клеточной поверхности, лежат два параметра: наличие/отсутствие гемагглютинирующей активности (способности взаимодействовать с сиаловыми кислотами) и наличие/отсутствие нейраминидазной активности (способности отщеплять остатки сиаловых кислот). Для родов Respirovirus, Rubulovirus и Avulavirus характерно наличие фермента гемагглютинин-нейраминидазы (NH), который способен связываться на клеточной поверхности с гликопротеинами и гликолипидами, содержащими в своём составе сиаловые кислоты (гемагглютинирующая активность (H)), и затем отщеплять остатки сиаловых кислот как с клеточной мембраны, так и с вирусных гликопротеинов (нейраминидазная активность (N)), тем самым предотвращая самоагглютинацию вирионов в процессе почкования. Для представителей рода Morbilivirus характерно наличие Н-белка, не обладающего нейраминидазной активностью. Вирусный гликопротеин генипавирусов не обладает ни гемагглютинирующей, ни нейраминидазной активностью, вследствие чего получил название G-белка (Glycoprotein).

Белки слияния парамиксовирусов (F-белки) являются гликопротеинами первого типа, структура которых предполагает наличие гидрофобного пептида, двух гептадных повторов, трансмембранного домена, обеспечивающего заякоривание в мембране, а также С-концевого цитоплазматического хвоста. Белок F синтезируется в виде неактивного предшественника F0, который затем, в процессе гликозилирования и протеалитического расщепления на две субъединицы F1 и F2, приобретает каталитическую активность. При этом происходит образование дисульфидной связи между субъединицами F1 и F2. Кроме того, вследствие перестройки гептадных повторов формируется структура шестиспирального пучка, что является одним из ключевых этапов в процессе созревания F-белка. Для некоторых вирусов такой активирующий протеолиз осуществляется внеклеточными протеазами.

Если с внешней стороны вирусной липидной оболочки экспонированы поверхностные антигены, то с внутренней стороны к ней прилегает слой из негликозилированного матриксного белка М, играющего ключевую роль в процессе сборки вирусной частицы. Маленький, основной, умеренно гидрофобный М-белок имеет довольно высокий уровень экспрессии в клетке. Последовательность данного белка консервативна среди представителей семейства Paramyxoviridae.

Жизненный цикл вируса

Оболочечные вирусы могут проникать в клетки либо с помощью рецепторно-опосредованного эндоцитоза, либо за счёт непосредственного слияния вирусной оболочки и плазматической мембраны клетки. Хотя считалось, что парамиксовирусы попадают в клетку после слияния с плазматической мембраной клетки, в последнее время были получены доказательства более комплексного механизма проникновения в клетку, по крайней мере для некоторых представителей семейства. Предварительная интернализация вирусной частицы была отмечена для вируса Сендай и вируса Нипах. Показано, что для вируса болезни Ньюкасла возможен клатрин-опосредованный путь эндоцитоза.

Парамиксовирусы – вирусы с рН-независимыми белками слияния, так как большинство представителей данного семейства могут эффективно инфицировать клетки в присутствии таких химических агентов, как хлорид аммония, используемых для повышения эндосомального значения рН. Некоторые вирусы с рН-независимыми белками слияния могут использовать и различные направления эндоцитозного пути.

Белки слияния парамиксовирусов способны индуцировать слияние плазматических мембран заражённой клетки с соседней незаражённой клеткой, приводя к образованию гигантской многоядерной клетки (синцитию).

Слияние клеточной и вирусной мембран является неотъемлемым этапом в жизненном цикле оболочечных вирусов. Для того чтобы в липидном бислое образовалась пора, через которую возможна передача вирусного генома, вирусу необходимо сообщить плазмалемме достаточное количество энергии. В этом энергозависимом процессе принимают участие белки слияния, включая белок оболочки ВИЧ (env), белок HA вируса гриппа и группу F-белков парамиксовирусов, которые, выступая в качестве молекулярных машин, запускают слияние мембран, претерпевая значительные конформационные изменения. Несмотря на то что эти белки обладают незначительной гомологией по последовательности, они имеют ряд характерных особенностей, к числу которых относят гликозилирование и тримеризацию.

F-белки парамиксовирусов, как и другие белки слияния мембран I класса, до момента активации находятся в своей метастабильной конформации (высокоэнергетическое состояние). При дальнейшем активирующем протеолизе, запускающем серию конформационных изменений в молекуле F-белка, способствующих приобретению им более стабильной конформации (низкоэнергетическое состояние), высвобождается энергия, необходимая для инициации слияния мембран.

Процесс репликации парамиксовирусов протекает исключительно в цитоплазматическом компартменте. После того как белки G, H или NH связались с соответствующими рецепторами на клеточной поверхности, белок F индуцирует pH-независимое слияние вирусной оболочки с плазматической мембраной клетки хозяина, в результате чего вирусный нуклеокапсид диссоциирует от М-белка и высвобождается в цитоплазму клетки. Механизм диссоциации комплекса M-белка и нуклеокапсида пока неизвестен. Для многих парамиксовирусов для эффективного слияния мембран необходима экспрессия обоих типов поверхностных гликопротеидов F- и NH- или F- и H-белков соответствующих вирусов. Высвобождение нуклеокапсида в цитоплазму приводит к активации полимеразного комплекса P-L и интенсивной транскрипции вирусных генов. Транскрипция вирусных генов происходит в соответствии с моделью «стоп-старт», в результате синтезируется градиент парамиксовирусных мРНК N> P> M> HN> F> L. Накопление достаточного количества структурных вирусных белков приводит к запуску антигеномного синтеза. Продукты этого синтеза затем используются тем же полимеразным комплексом L-P для продукции точных комплементарных копий геномной РНК. Для эффективной репликации вирусного генома необходимо, чтобы его длина была кратной 6 нуклеотидам. Так называемое «правило 6 нуклеотидов» следует учитывать при создании генно-инженерных конструкций на основе генома парамиксовирусов. Формирование нуклеокапсида протекает в два этапа: новосинтезированный NP-белок связывается с возникающей в процессе репликации РНК и формирует рибонуклеопротеин, с которым в дальнейшем взаимодействуют полимеразные комплексы L-P.

Вирусные гликопротеины синтезируются в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), после чего транспортируются в компартменты гладкого ЭПР и/или аппарата Гольджи, где подвергаются посттрансляционным модификациям. Гликопротеины, взаимодействующие с рецептором на клеточной поверхности [гликопротеин (G)/гемагглютинин (H)/гемагглютинин-нейраминидаза (NH)], относятся к гликопротеинам второго типа, для которых характерно наличие гидрофобного домена на N-конце, выполняющего сигнальную функцию; он же обеспечивает заякоривание белка в плазматической мембране клетки.

Сборка вирусной частицы происходит на плазматической мембране инфицированной клетки: все её компоненты, т. е. нуклеокапсид, матриксный белок, гликопротеины оболочки F и NH/H/G транспортируются к клеточной мембране, и вирион высвобождается путём почкования. При этом вирусная частица приобретает липидную оболочку, в состав которой уже входят мембранные гликопротеины, обеспечивающие вирион способностью проникать и инфицировать другие клетки организма-хозяина.

Жизненный цикл парамиксовирусов (Paramyxoviridae).Жизненный цикл парамиксовирусов (Paramyxoviridae).Согласно одной из гипотез, ключевая роль при сборке вирусных частиц отводится матриксному белку. Считается, что он выстилает изнутри плазматическую мембрану клетки и тем самым способствует концентрации рибонуклеокапсида и белков F и NH/H/G на сайтах сборки вирионов. В пользу данной гипотезы свидетельствует тот факт, что колокализация вирусных гликопротеинов и вирусного нуклеокапсида была значительно уменьшена в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом кори с делетированным геном М. Считается, что взаимодействие матриксного белка с цитоплазматическим хвостом гликопротеинов необходимо для специфического размещения гликопротеинов в вирионе.

Онколитические свойства вирусов

К перспективным онколитическим агентам относят аттенуированный вирус кори, вирус эпидемического паротита, низкопатогенный вирус болезни Ньюкасла и вирус Сендай.

Часто на поверхности опухолевых клеток в большом количестве представлены молекулы, которые могут служить рецепторами для онколитических парамиксовирусов, благодаря чему происходит более специфичное прикрепление вируса именно к злокачественным клеткам. В частности, на поверхности опухолевых клеток выше уровень сиаловых кислот, которые являются рецепторами для вирусных белков H и NH, отвечающих за прикрепление парамиксовирусов к клетке.

Парамиксовирусная инфекция протекает с образованием синцитиев – нежизнеспособных многоядерных структур из заражённых и незаражённых опухолевых клеток. Формирование таких синцитиев возможно благодаря F-белку, который способен образовать пору между заражённой и незаражённой клетками. Сливаться в синцитий способны десятки клеток, в конечном счёте такой конгломерат из клеток погибает, однако благодаря такому механизму вирус способен вовлекать новые клетки опухоли в инфекционный процесс и одновременно ускользать от нейтрализующего воздействия антител. Кроме того, парамиксовирусы способны вызывать усиленный противоопухолевый иммунный ответ.

Результаты доклинических и клинических исследований дают основания полагать, что онколитические парамиксовирусы могут стать перспективным дополнением к существующим подходам противоопухолевой терапии. Благодаря репликации в цитоплазме парамиксовирусы не могут встраиваться в геном клетки, что делает их сравнительно безопасными для применения в терапевтическом онколизе по сравнению с ретровирусами или другими ДНК-содержащими вирусами.

Распространение вируса в природе. Вакцины

Протекание инфекций, вызванных парамиксовирусами, сопровождается серьёзными патологиями дыхательного тракта. В настоящее время не существует эффективных вакцин против ВП I–III типов. В то же время, несмотря на то что вакцины против вируса кори и вируса паротита разработаны, данные заболевания продолжают оставаться не до конца разрешённой проблемой: за последнее время в развитых странах, таких как Великобритания, Канада, США, наблюдались вспышки эпидемий, связанные с низким уровнем вакцинации. Протекание инфекций, вызванных генипавирусами (вирусами Хендра и Нипах), сопровождается сильным васкулитом и энцефалитом, коэффициент смертности при этом составляет 40 %. Среди других парамиксовирусов, имеющих сельскохозяйственное значение, выделяют вирус болезни Ньюкасла, который вызывает легко передающееся респираторное и неврологическое заболевание многих видов птиц, в том числе кур, а также вирус чумы крупного рогатого скота (Rinderpest morbillivirus). Моделями, применяемыми в лабораторной практике для изучения процессов жизнедеятельности парамиксовирусов, стали вирус парагриппа V типа и вирус Сендай.