Синтети́ческие олигонуклеоти́ды, относительно короткие (до 200 нуклеотидов) фрагменты нуклеиновых кислот, полученные с помощью химического синтеза. Находят широкое применение в биотехнологии, молекулярной биологии и медицине.

Впервые термин «олигонуклеотиды» применил в 1962 г. А. М. Майкельсон, ученик А. Р. Тодда и автор первой монографии по химии нуклеозидов и нуклеотидов. Часть термина «олиго» заимствована из химии углеводов, где олигомерами (от олиго... и греч. μέρος – часть, повторение) называют соединения, которые по размеру молекул занимают промежуточное положение между мономерами и полимерами.

Модифицированные олигонуклеотиды

Синтетические олигонуклеотиды содержат как природные рибо- и дезоксинуклеозиды, так и модифицированные звенья, которые встраивают в олигонуклеотид в процессе химического синтеза в заранее заданное положение олигомерной цепи и в любом количестве. Введение модифицированных фрагментов в олигонуклеотидную цепь позволяет значительно расширить комплекс задач, решаемых с помощью синтетических фрагментов нуклеиновых кислот, в том числе существенно улучшить проникновение фрагментов ДНК через клеточные мембраны, повысить устойчивость к действию клеточных нуклеаз, увеличить термодинамическую стабильность дуплексов, образуемых олигонуклеотидами с комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот, улучшить фармакокинетические и фармакодинамические свойства олигонуклеотидов. Встраивание в олигонуклеотид химически активных групп даёт возможность получить разнообразные конъюгаты с молекулами пептидов, красителей и др.

В принципе, возможно постсинтетическое введение статистических модификаций или модификаций по 3'- и/или 5'-концу олигонуклеотидов, однако наиболее универсальным методом является направленное встраивание модифицированного звена в заранее заданное положение олигомерной цепи в процессе химического синтеза. Модификации можно вводить как по концевым фрагментам олигонуклеотидов, так и внутри цепи. Замена или введение дополнительных группировок может происходить по межнуклеотидной фосфатной группе, углеводному фрагменту или гетероциклическому основанию. Можно выделить определённую направленность в изменении свойств при введении модификаций, в частности изменение углеводо-фосфатного остова приводит к повышению устойчивости в отношении нуклеаз и изменению стабильности дуплексов с нуклеиновыми кислотами, тогда как присоединение определённых заместителей по 3'- и/или 5'-концам значительно улучшает проникновение олигонуклеотидов в клетки.

Химический синтез ДНК

История химического синтеза ДНК началась через два года после открытия двойной спирали Дж. Уотсоном и Ф. Криком. Первая классическая работа была опубликована в 1955 г. А. Майкельсоном и А. Тоддом (Michelson. 1955), которые представили синтез динуклеотида с использованием соединений трёхвалентного фосфора. Синтез был малоэффективен (выход составил 1–2 %), однако эта работа имеет историческое значение как первый пример использования защитных групп и методов фосфорилирования, а также применения прогрессивных для того времени способов выделения целевого соединения с помощью бумажной хроматографии.

В 1973–1974 гг. синтез одного 11-звенного олигонуклеотида у одного исследователя занимал примерно год. Совершенствовать олигонуклеотидный синтез можно было в сторону увеличения скорости образования межнуклеотидных связей или повышения выхода целевых продуктов реакций. Этих целей удалось достичь при использовании фосфиттриэфирного (амидофосфитного, фосфорамидитного) метода, предложенного группой учёных во главе с М. Карузерсом, что позволило в начале 1980-х гг. превратить олигонуклеотидный синтез в эффективный автоматизированный процесс (Barone. 1984). Преимуществом метода является высокая эффективность конденсации между 5'-гидроксильной и 3'-О-(N,N-диизопропил-β-цианэтил)амидофосфитной группировками соответствующим образом защищённых нуклеозидов в присутствии конденсирующего агента – тетразола или его производных. Механизм реакции приведён на схеме.

В 1980 г. в Кембридже был создан первый ручной синтезатор олигонуклеотидов, а в 1983 г. компания Applied Biosystems выпустила первый автоматический синтезатор, использующий амидофосфитный метод. В то же время в Москве (МГУ имени М. В. Ломоносова) и Новосибирске (НИБОХ АН СССР) учёными и инженерами Специального конструкторско-технологического бюро специальной электроники и аналитического приборостроения (ныне Конструкторско-технологический институт прикладной микроэлектроники, филиал Института физики полупроводников имени А. В. Ржанова СО РАН) предпринимались попытки, с одной стороны, разработать оптимальный полимерный носитель для автоматического синтеза, а с другой – создать синтезатор собственной конструкции (З. А. Шабарова, В. К. Потапов, Д. Г. Кнорре). Был создан полимер на основе тефлона с привитым дивинилбензолом и появился ДНК-синтезатор «Виктория», который достаточно успешно использовался в отечественных лабораториях (Potapov. 1979).

Ныне существуют автоматические синтезаторы для одновременного синтеза большого набора олигонуклеотидов различной последовательности и ДНК-машины для получения единственного соединения, но в большом количестве (десятки граммов). Синтетические фрагменты нуклеиновых кислот дезоксирибо- и риборяда, а также многие модифицированные олигомеры, как и все компоненты олигонуклеотидного синтеза, являются коммерчески доступными.

Ситуация в области синтеза нуклеиновых кислот складывается следующим образом: 1) хорошо разработан синтез как природных олигонуклеотидов, так и их производных практически любой длины с самыми различными модификациями, которые повышают потенциал их использования по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами; 2) соединения, стоимость которых ещё недавно делала невозможным их практическое использование, стали доступными благодаря постоянному совершенствованию методов их синтеза, анализа и выделения.

Существующая методология синтеза обеспечивает потребности исследователей в олигонуклеотидах заданной последовательности. Это подтверждается тем, что олигонуклеотидный синтез с помощью автоматических синтезаторов ДНК способен осуществлять даже непрофессиональный химик. Тем не менее расширение областей использования олигонуклеотидов делает актуальной разработку новых вариантов модификации межнуклеотидных фосфатных групп и самих нуклеозидов, что способствует развитию методов органической химии в целом.

Применение синтетических олигонуклеотидов

Важнейшим и уникальным свойством олигонуклеотидов является их способность образовывать специфические комплексы с комплементарными последовательностями ДНК и РНК. Именно это свойство, а также относительная химическая стабильность лежат в основе широкого применения олигонуклеотидов в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Олигонуклеотиды имеют неоценимое значение для развития таких методов, как секвенирование ДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), диагностика нуклеиновых кислот, генно-инженерные манипуляции.

Ныне олигонуклеотиды используются в микрочипах, гибридизации in situ, антисмысловой технологии и в качестве носителей лекарств, тестируются в диагностике и терапии заболеваний, что способствует разработке инновационных лекарств и технологий, чрезвычайно востребованных на рынке биотехнологии и фармацевтики. Действие синтетических олигонуклеотидов в качестве потенциальных лекарственных средств, блокирующих функционирование «вредных» белков, может быть осуществлено или непосредственным воздействием на эти белки, или в результате направленного воздействия на кодирующие эти белки нуклеиновые кислоты – ДНК, пре-мРНК, мРНК.