Биолюминесце́нтная систе́ма острако́д ро́да Cypridina, набор белков и небольших органических молекул, позволяющих представителям рода Cypridina испускать свет. Ключевые компоненты системы: люциферин (варгулин) и фермент люцифераза, которые производят разные типы железистых клеток специальной железы. Биолюминесцентная система ракообразных рода Cypridina достаточно хорошо изучена, но пока не нашла широкого применения в биотехнологии, а количество созданных на её основе инструментов исследований довольно ограниченно.

Cypridina – один из родов мелких (обычно размером 1–2 мм) беспозвоночных животных, относящихся к классу ракушковых ракообразных, или остракод (Ostracoda). Он включает в себя около 25 видов, в основном обитающих в морских водах у берегов Японии, в Мексиканском заливе, Карибском море и у побережья Калифорнии. Наиболее известный представитель – Cypridina (Vargula) hilgendorfii – ведёт ночной образ жизни и способен выделять светящийся ярким голубым светом секрет в морскую воду.

В ответ на нападение хищника происходит выброс секретов железы в воду, что приводит к началу биолюминесцентной реакции и образованию ярко светящегося облака, которое отпугивает или сбивает с толку нападавшего, давая возможность жертве скрыться в окружающей темноте. При этом максимум биолюминесценции зависит от рН и ионной силы раствора, в которой происходит реакция. Он колеблется между 448 и 463 нм, с максимумом в 452 нм в морской воде (Shimomura. 2006). Рачки рода Cypridina используют для биолюминесценции свой, уникальный люциферин, в то время как биолюминесцентные виды других семейств класса Ostracoda, например Halocypridoidae и Conchoecia, – целентеразин (Identification of the luciferin-luciferase system ... 2004).

История изучения

Первые эксперименты с биолюминесцентной системой представителей рода Cypridina проводил в 1916 г. профессор Э. Н. Харви. Его привлекла яркость свечения животных, а также лёгкость хранения материала, собранного для изучения: даже после хранения в течение десятилетий в помещении, где температура порой поднималась до 30 ^оС, биоматериал сохранял способность к биолюминесценции. Несмотря на это, люциферин рачков Cypridina hilgendorfii был выделен в чистом виде и охарактеризован Осаму Симомурой только в 1957 г. (Shimomura. 1957). Вещество оказалось исключительно нестабильным в присутствии воздуха, особенно в загрязнённых растворах, поэтому выделение его из природного биоматериала было крайне сложной задачей. Изменения в методике выделения позволили получить кристаллы люциферина рачков Cypridina (варгулин) и расшифровать его структуру (Cypridina bioluminescence I Sructure of luciferin. 1966.; Kishi. 1966).

Работы по выделению и клонированию люциферазы ракообразных Cypridina начались ещё в 1960-х гг. (Shimomura. 2006). Первая клонированная люцифераза Cypridina hilgendorfii была получена в 1989 г. (Thompson. 1989), и значительно позже была клонирована люцифераза Cypridina noctiluca (Nakajima. 2004).

Люциферин остракод – варгулин

Структурная формула люциферина остракод рода Cypridina.Структурная формула люциферина остракод рода Cypridina.Молекула люциферина рачков Cypridina – варгулина – имеет в своей основе 3 аминокислотных остатка: аргинин, изолейцин и триптофан. После установления структуры был разработан метод его синтеза (White. 1971; Cypridina bioluminescence VI ... 1969; Convergent and short-step syntheses of dl-Cypridina luciferin ... 2000).

Люциферазы

Сравнение аминокислотных последовательностей люцифераз Cypridina hilgendorfii и Cypridina noctiluca показало очень высокую степень их гомологии (около 84 %), но не выявило значимой гомологии при сравнении с другими известными люциферазами. Однако активность люциферазы Cypridina noctiluca гораздо выше, чем у Cypridina hilgendorfii (cDNA cloning and characterization ... 2004).

Люциферазы ракообразных Cypridina (Cypridina luciferase, CLuc) – это секретируемые белки с молекулярной массой около 62 кДа. Спектр биолюминесценции Cypridina зависит от ионной силы раствора, в котором проходит реакция, и практически не зависит от его рН. Максимум биолюминесценции лежит в пределах 448–463 нм (Shimomura. 2006).

Квантовый выход реакции, катализируемой CLuc, – один из самых высоких среди всех известных люцифераз (Shimomura. 1970). Биолюминесцентная реакция, катализируемая CLuc, сильно ингибируется добавлением этилендиаминтетраацетата натрия, что, по-видимому, связано с вовлеченностью в процесс ионов двухвалентных металлов, таких как кальций и магний. Однако никаких структурных мотивов, ответственных за связывание ионов кальция, в аминокислотных последовательностях люцифераз ракообразных Cypridina обнаружено не было. Наличие в структуре большого числа дисульфидных связей (16 связей) делает практически невозможной экспрессию их генов в прокариотических экспрессионных системах.

Люциферин-люциферазная реакция

Биолюминесцентная реакция люциферина у остракод рода Cypridina.Биолюминесцентная реакция люциферина у остракод рода Cypridina.Ещё до установления структуры люциферазы рачков Cypridina было показано, что для биолюминесценой реакции необходимы только люциферин, кислород и люцифераза. Схема реакции была предложена в 1967 г. Ф. МакКапрой (McCapra. 1967) и впоследствии подтверждена в работах других учёных (Shimomura. 1971).

Применение

Люциферазы ракообразных Cypridina пока не нашли широкого применения в биотехнологии, но тем не менее различные группы учёных создают новые биомедицинские инструменты и приложения на их основе. На основе люциферазы Cypridina hilgendorfii разработаны методы анализа по репортёрным генам, данная люцифераза используется в качестве репортёра в химерных конструкциях для биоимиджинга и иммунологических исследований. На основе люциферазы Cypridina noctiluca созданы различные методики и BRET-пары (от англ. bioluminescence resonance energy transfer – биолюминесцентный резонансный перенос энергии) с HyLite FluorTM и квантовыми точками.