Ме́тод Гра́ма, метод дифференциации микроорганизмов по составу клеточной стенки. На основании окрашивания бактерии делятся на грамположительные (фиолетовый цвет) и грамотрицательные (розовый или красный цвет). Окрашивание по Граму часто является первым диагностическим тестом для оценки инфекций. Использование окраски по Граму позволяет быстро выбрать соответствующие антибиотики. Метод Грама широко распространён в пищевой, медицинской и ветеринарной лабораторной практике.

История создания метода

Датский физиолог и бактериолог Ханс Кристиан Грам искал метод, позволяющий визуализировать кокки в срезах тканей лёгких людей, умерших от пневмонии. На 1882 г. уже был доступен метод окрашивания, разработанный Робертом Кохом для визуализации бацилл турберкулёза, но не позволял специфически определить бактерии вида пневмококк. Впервые Грам описал новый метод в 1884 г. в статье «О дифференцирующей окраске шизомицетов: в выделенных и высушенных препаратах» и предложил использовать его в основном для выявления микроорганизмов, вызывающих пневмонию. Он обнаружил, что новый метод окраски позволяет визуализировать ряд бактерий, связанных со стрептококковыми инфекциями, например вызывающими скарлатину (Streptococcus pyogenes), однако бациллы брюшного тифа (Salmonella Typhi) легко обесцвечивались после окрашивания кристаллическим фиолетовым и йодом при добавлении этанола. На момент написания своей первой публикации Грам только окончил обучение медицине и писал, что знает о недостатках и несовершенстве метода.

С 1884 г. предложены модификации метода Грама, например, в 1921 г. Виктор Берк (американский бактериолог) предлагал добавлять бикарбонат натрия к раствору кристаллического фиолетового, т. к. он предотвращает окисление раствора, а в 1922 г. Н. Копелофф (американский педиатр) писал об использовании спирта в качестве обесцвечивающего реагента. Используются и другие модификации окраски по Граму, такие как окраска по Граму в модификации Аткинса, окраска по Граму в модификации Берка и др.

В России общепринятая модификация окрашивания по Граму была опубликована в 2015 г. в межгосударственном стандарте по методам бактериологического анализа мяса и входит в перечень обязательных шагов при дифференцировке микроорганизмов в соответствии с актуальными межгосударственными стандартами Российской Федерации (ГОСТ 21237-75 Мясо. Методы бактериологического анализа).

Суть метода

На фиксированный на предметном стекле мазок наносится кристаллический фиолетовый краситель. Через 10–30 с излишки красителя смываются водой. Далее на мазок наносится раствор йода на 10–30 с. Этот шаг известен как «фиксация красителя». Раствор йода сливают, предметное стекло промывают проточной водой. Затем происходит этап обработки растворителем: на предметное стекло добавляется несколько капель обесцвечивающего вещества, часто это смешанный растворитель из этанола и ацетона. Предметное стекло промывают водой в течение 5 с. На этапе контрастного окрашивания мазок докрашивается основным раствором фуксина в течение 40–60 с. Раствор фуксина для контрастного окрашивания смывают водой, избыток воды промокают салфеткой, а предметное стекло сушат на воздухе. В некоторых современных модификациях метода в качестве контрастного красителя рекомендуется использовать сафранин. Однако фуксин окрашивает грамотрицательные микроорганизмы более интенсивно, а Hemophilus spp., Legionella spp. и некоторые анаэробные бактерии не окрашиваются сафранином. Бактерии, окрашенные по Граму, рассматривают в поле зрения светового микроскопа при увеличении в 1 тыс. раз с использованием иммерсионного масла.

Для окрашивания по Граму используются различные клинические образцы: моча, мокрота, кровь, спинномозговая, синовиальная, плевральная и другие биологические жидкости. Также используются мазки из дыхательных путей, прямой кишки, шейки матки и т. д. Сбор образцов всегда должен осуществляться в стерильных контейнерах, чтобы минимизировать риск контаминации.

Грамположительные микроорганизмы имеют более высокое содержание пептидогликана в стенке бактериальной клетки, тогда как грамотрицательные организмы имеют более высокое содержание липидов. Изначально все бактерии поглощают кристаллический фиолетовый, однако при использовании растворителя липидный слой грамотрицательных организмов растворяется. При растворении липидного слоя грамотрицательные бактерии теряют первичную окраску. А стенки грамположительных закрываются под действием растворителя, предотвращая обесцвечивание. После обесцвечивания грамположительные бактерии остаются пурпурными, а грамотрицательные клетки вновь окрашиваются при добавлении контрастного красителя. По завершении окрашивания по Граму грамположительные клетки становятся фиолетовыми, а грамотрицательные – от розового до красного.

Не все организмы могут быть точно определены с помощью окраски по Граму. Существуют грамвариабельные бактерии, которые не могут быть отнесены ни к грамположительным, ни к грамотрицательным организмам. В таких образцах видна смесь розовых и фиолетовых клеток. Примером являются представители рода гарднерелла (Gardnerella). Они имеют необычную грамположительную структуру клеточной стенки, которая заставляет бактерии этого рода окрашиваться как грамотрицательные или грамвариабельные.

Некоторые роды могут быть ошибочно отнесены к другому классу. Например, актиномицеты имеют клеточные стенки, особенно чувствительные к разрушению во время клеточного деления, что приводит к грамотрицательному окрашиванию этих грамположительных клеток. А в культурах бацилл уменьшение толщины пептидогликана в процессе роста ведет к окрашиванию их грамотрицательно. Кроме того, для всех бактерий, окрашенных по Граму, возраст культуры, а также предварительная обработка их антибиотиками может влиять на результаты окрашивания. Неверная интерпретация окраски по Граму ведет к неправильной и поздней диагностике инфекционного заболевания.