Опти́ческая микроскопи́я, общее название методов наблюдения объектов, не различимых человеческим глазом, с использованием оптического микроскопа. Структуру объекта можно различить, если разные его частицы по-разному поглощают и отражают свет либо отличаются одна от другой (или от среды) показателями преломления. Эти свойства обусловливают различие амплитуд и фаз световых волн, прошедших через разные участки объекта, и от этого зависит контрастность изображения. Разные методы наблюдения, применяемые в оптической микроскопии, выбираются в зависимости от свойств изучаемого объекта (препарата).

Метод светлого поля в проходящем свете

Применяется при исследовании прозрачных препаратов с включёнными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами. Таковы, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов.

Рис. 1. Схема оптического микроскопа.Рис. 1. Схема оптического микроскопа.В отсутствие препарата лучи от источника света 1 (рис. 1) через коллектор 2 и конденсор 5 проходят через объектив 7 и дают равномерно освещённое поле в плоскости полевой диафрагмы 9 окуляра 10. Если в препарате, расположенном на предметном столике 6, имеется абсорбирующий элемент (частица), то он частично поглощает и рассеивает падающий на него свет, вследствие чего амплитуда света, прошедшего через эту частицу, будет меньше, и частица выглядит тёмным пятном на светлом фоне, что и обусловливает, согласно дифракционной теории, возникновение изображения. Метод можно использовать и в случае неабсорбирующих частиц, если они рассеивают освещающий пучок так сильно, что бóльшая часть пучка не попадает в объектив.

Метод светлого поля в отражённом свете

Применяется для наблюдения непрозрачных объектов, например шлифов металлов. Освещение препарата 4 (рис. 2) производится от осветителя 1 и полупрозрачного зеркала 2 сверху через объектив 3, который выполняет одновременно и роль конденсора.

Рис. 2. Наблюдение объектов методом светлого поля в отражённом свете.Рис. 2. Наблюдение объектов методом светлого поля в отражённом свете.Промежуточное изображение создаётся в плоскости 6 объективом совместно с тубусной линзой 5. Структура препарата видна вследствие различия отражательной способности его элементов. На светлом фоне наблюдаются тёмные изображения неоднородностей структуры поверхности.

Метод тёмного поля в проходящем свете

Применяется для получения изображений прозрачных, неабсорбирующих объектов. Свет от источника 1 (рис. 3) через коллектор 2 проходит специальный конденсор тёмного поля 4, содержащий кольцевую диафрагму 3. Каждая точка препарата 5 освещается световым пучком в виде полого конуса. В отсутствие рассеивающих элементов свет непосредственно в объектив 6 не попадает. Рис. 3. Наблюдение объектов методом тёмного поля в проходящем свете.Рис. 3. Наблюдение объектов методом тёмного поля в проходящем свете.Объектив создаёт в плоскости полевой диафрагмы 7 окуляра 8 изображение только тех элементов препарата, на которых произошло рассеяние света. На тёмном фоне видны светлые изображения частиц, отличающихся от окружающей среды показателем преломления.

Этот метод, используемый также в ультрамикроскопах (в них препарат освещают перпендикулярно направлению наблюдения), даёт возможность обнаруживать сверхмелкие детали, размеры которых (порядка 2 нм) значительно меньше пределов разрешения наиболее сильных микроскопов. Однако при этом изображения частиц имеют вид дифракционных точек и их истинную форму нельзя определить.

Метод тёмного поля в отражённом свете

Используется для исследования непрозрачных препаратов (например, шлифов металлов) с высоким коэффициентом отражения. Осветительный канал состоит из источника света 1, коллектора 2, дополнительной линзы 4, в фокусе которой устанавливают кольцевую диафрагму 3 (рис. 4). Световой поток в виде полого цилиндра, отражаясь от полупрозрачного зеркала 5, попадает на параболическое зеркало 6 (эпиконденсор). Каждая точка препарата 7 освещается световым пучком в виде полого конуса.

Рис. 4. Наблюдение объектов методом тёмного поля в отражённом свете.Рис. 4. Наблюдение объектов методом тёмного поля в отражённом свете.При отсутствии каких-либо дефектов или рассеивающих элементов на поверхности объекта свет, зеркально отражаясь от поверхности, непосредственно в объектив 8 не попадает. Объектив совместно с тубусной линзой 9 создаёт в плоскости полевой диафрагмы 10 окуляра 11 изображение только тех элементов препарата, на которых произошло диффузное рассеяние света. На тёмном фоне видны светлые изображения частиц структуры поверхности.

Поляризационная микроскопия

Это метод наблюдения в проходящем и отражённом поляризованном свете. Применяется для исследования анизотропных объектов (минералы, ру́ды, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и клетки). При наблюдении в параллельных лучах (ортоскопический метод) с помощью анализаторов и компенсаторов, которые включены в оптическую систему, изучается изменение поляризации света, прошедшего через препарат. В этом случае можно определить анизотропию показателей преломления и поглощения образца, его оптическую активность и др. При включении в оптическую систему микроскопа линз Лазо и Бертрана наблюдение объекта происходит в сходящихся лучах (коноскопический метод); при этом исследуются ориентировка кристалла, количество и направление его осей.

Метод фазового контраста

Служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов (например, живых неокрашенных животных тканей), невидимых при наблюдении методом светлого поля. Даже при малом различии показателей преломления объекта и среды или их толщин световая волна, прошедшая сквозь них, претерпевает различные изменения по фазе и приобретает т. н. фазовый рельеф. Эти фазовые изменения с помощью фазовой пластинки (фазового кольца), расположенной вблизи заднего фокуса объектива, преобразуются в изменения яркости (амплитудный рельеф). Лучи, прошедшие через препарат, полностью проходят через фазовое кольцо, которое изменяет их фазу на ${π/2}$. Лучи, рассеянные в препарате (отклонённые), не попадают в фазовое кольцо и не получают дополнительного сдвига фазы. С учётом фазового сдвига, внесённого самим препаратом, разность фаз между отклонёнными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или ${π}$. В результате интерференции света в плоскости изображения препарата формируется контрастное изображение его структуры, в котором распределение яркостей воспроизводит фазовый рельеф.

Метод интерференционного контраста

Состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается: один проходит сквозь наблюдаемую частицу, а второй – мимо неё. В окулярной части микроскопа оба луча соединяются с разностью хода ${δ = Nλ = (n_{ч} – n_{ср})d}$ и интерферируют ($n_{ч}$ и $n_{ср}$ – показатели преломления частицы и окружающей среды, ${d}$ – толщина частицы, λ – длина волны света, ${N}$ – порядок интерференции).

Сходство методов интерференционного и фазового контраста состоит в том, что оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается главным образом в возможности с высокой точностью (до ${λ/300}$) измерять разности хода лучей, вносимые микрообъектом, используя оптические компенсаторы. На основании этих измерений можно рассчитать, например, общую массу и концентрацию сухого вещества в клетках биологических препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Основана на явлении люминесценции, либо свойственной самому микрообъекту, либо полученной им после специальной окраски. Под микроскопом изучается зелёно-оранжевое свечение объекта, возникающее при его освещении сине-фиолетовым или УФ-излучением. Для этой цели перед конденсором и после объектива микроскопа вводят соответствующие светофильтры. Первый из них пропускает от источника-осветителя только излучение, вызывающее люминесценцию объекта, второй (после объектива) пропускает к глазу наблюдателя только свет люминесценции. Метод применяется в микробиологии, цитологии, микрохимическом анализе, дефектоскопии и т. п.

Ультрафиолетовая микроскопия

Позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа, пропорциональную ${1/λ}$. Этот метод расширяет возможности микроскопических исследований также за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ-излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы на УФ-изображениях. Изображения в УФ-микроскопии регистрируют фотографированием, с помощью электронно-оптического преобразователя, приёмника зарядовой связи, люминесцирующего экрана.

Инфракрасная микроскопия

Для наблюдения в ИК-лучах также необходимо преобразование невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования, видеосъёмки или с помощью электронно-оптического преобразователя. ИК-микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стёкол, некоторых кристаллов, минералов.