Эксцизионная репарация оснований
Эксцизио́нная репара́ция основа́ний (ЭРО), механизм устранения небольших повреждений последовательности ДНК посредством распознавания повреждённого азотистого основания ферментами ЭРО, его удаления с последующим разрывом одной цепи ДНК и образованием апуринового или апиримидинового сайта (АП-сайта), после чего происходит синтез удалённого участка. Применяется по отношению к большинству нетипичных азотистых оснований.
История открытия и изучения
В 1960-х гг. были очищены и охарактеризованы многие ферменты эксцизионной репарации оснований кишечной палочки (Escherichia coli). Во 2-й половине 1960-х описана эндонуклеаза, расщепляющая АП-сайты, в начале 1970-х – урацил-ДНК-гликозилаза. В 1970–1980-е гг. идентифицированы, клонированы и описаны многие гены, вовлечённые в ЭРО. К концу 1990-х гг. механизм ЭРО выяснен в общих чертах, однако эффективность рекомбинантных белков ЭРО, в частности ДНК-гликозилаз, к тому времени изучена недостаточно.
Этапы ЭРО
Процесс состоит из нескольких этапов: распознавание повреждённого основания, выворачивание основания из двойной цепи наружу (base-flipping), гидролиз N-гликозидной связи, одноцепочечный разрыв и удаление небольшого фрагмента, синтез удалённого участка [создание заплатки, патча (patch)], сшивка разрыва.
Водородная связь между N7-H 8-оксогуанина и остатком глицина.Ферменты ЭРО распознают специфичное повреждённое основание за счёт его особых взаимодействий с активным центром конкретного фермента. Например, у эукариот 8-оксогуанин-гликозилаза 1 (8-Oxoguanine DNA Glycosylase, OGG1) распознаёт 8-оксогуанин благодаря образованию водородной связи N7-H с остатком глицина, расположенным в активном центре фермента.
Идентифицированное повреждённое основание выворачивается из внутренней части двойной спирали наружу, что сопровождается изменением конформации белка и репарируемого участка молекулы ДНК. Двойная спираль сгибается, образуя тупой угол с вершиной в точке, в которой расположено повреждённое азотистое основание.
Разрыв N-гликозидной связи осуществляется специальными ферментами – ДНК-N-гликозилазами. Известно 11 человеческих гликозилаз, их относят к 3 суперсемействам в соответствии со структурными особенностями. По функционалу ДНК-гликозилазы, участвующие в ЭРО, подразделяют на моно- и бифункциональные. Принципиальное отличие бифункциональных гликозилаз заключается в их АП-лиазной активности – способности расщеплять АП-сайты.
Выпячивание 8-оксогуанина и изменение конформации двойной спирали ДНК.Предполагаемый механизм гидролиза гликозидной связи при ЭРО – мономолекулярное нуклеофильное замещение Sn1. Благодаря стабилизирующему влиянию активного центра фермента происходит диссоциация повреждённого основания и сахарофосфатного остова с образованием оксокарбениевого катиона. Также фермент катализирует нуклеофильную атаку по С1-атому. В случае монофункционального фермента нуклеофильный остаток аминокислоты (например, аспартат в белке Ung) активирует молекулу воды, которая в ходе реакции выступает в роли нуклеофила. Образуется АП-сайт. Если реакцию катализирует бифункциональная гликозилаза, в качестве нуклеофила выступает основный остаток аминокислоты (к примеру, остаток лизина в OGG1), активированный кислотным остатком (в белке OGG1 эту функцию выполняет аспартат). Промежуточным продуктом является основание Шиффа. Далее протекает β- или β,δ-элиминация. В результате катализа получается одноцепочечный разрыв, с 3’-стороны от которого образуются α,β,4-гидрокси-2-пентаналь при β-элиминировании или фосфатная группа при β,δ-элиминировании.
Следующей стадией является расщепление сахарофосфатного остова АП-лиазами (АП-эндонуклеазами) [APEX1 (APE1)], если катализатором выступает монофункциональная ДНК-гликозилаза. После процессинга АП-сайта белком APE1 остаётся разрыв, с двух сторон от которого находятся фосфатные группы.
Механизм работы моно- и бифункциональных гликозилаз.Синтез отсутствующего участка цепи может происходить по короткозаплаточному (с заменой 1 нуклеотида) или длиннозаплаточному (с заменой от 2 до 10 нуклеотидов) пути. Каждый из путей на последних стадиях задействует репаративные и репликативные ферменты. Репаративная ДНК-полимераза β (Pol β), кроме полимеразной активности, обладает dRP-лиазной активностью, т. е. способностью расщеплять дезоксирибозофосфаты, освобождая необходимую для синтеза заплатки гидроксильной группу с 3’-стороны от однонитевого разрыва.
Полимераза Pol β производит вставку первого нуклеотида на место удалённого. При использовании короткозаплаточного пути репарация завершается лигированием, катализируемым комплексом лигазы Lig III α и белком XRCC1. После вставки первого нуклеотида при использовании длиннозаплаточного пути в полимеразной реакции принимают участие репликативные полимеразы Pol δ/ε и факторы репликации PCNA и RFC, при этом синтез новой цепи сопровождается вытеснением фрагмента (флэпа), который будет удалён. Его отщепление осуществляется флэп-эндонуклеазой 1 (FEN1). Последним этапом является лигирование, производимое лигазой Lig I.
Схема работы GO-системы.Существует особая разновидность ЭРО – GO-система репарации, состоящая из 3 ферментов, функции которых дополняют друг друга. У прокариот в эту систему входят 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза [другие названия – формамидопиримидин-ДНК-N-гликозилаза, formamidopyrimidine-DNA glycosylase (Fpg), MutM], аденин-ДНК-гликозилаза гетеродуплексов (MutY) и 8-оксо-2’-дезоксирибогуанозин-5’-трифосфатпирофосфатаза (MutT). Функцией GO-системы является удаление 8-оксогуанина, предотвращение его включения в синтезируемую цепь и устранение последствий уже находящегося в составе ДНК 8-оксогуанозина. Фермент Fpg необходим для удаления 8-оксогуанина, спаренного с цитозином, но при этом имеет низкое сродство к дуплексу с аденином. Репарацию пары 8-оксогуанина с аденином осуществляет белок MutY посредством удаления второго из пары. Последний же фермент MutT катализирует реакции гидролиза рибо-8-оксогуанозин- и дезоксирибо-8-оксогуанозинтрифосфата, предотвращая их включение напротив аденина.
Схема работы ЭРО у эукариот.У эукариот также есть функциональные или структурные аналоги всех ферментов GO-системы: OGG1, MUTYH1 (MutY homolog – гомологи MutY) и NUDT1 (8-оксо-2’-дезоксирибогуанозин-5’-трифосфатпирофосфатаза), выполняющие функции ферментов Fpg, MutY и MutT соответственно. GO-система наиболее активна в условиях окислительного стресса.
Заболевания, связанные с ЭРО
Ген, кодирующий белок ЭРО | Ассоциированное заболевание |
mutyh [adenine-DNA glycosilase heteroduplexes – аденин-ДНК-гликозилаза гетеродуплексов, MutY homolog – гомологи MutY)] | Семейный аденоматозный полипоз. В сочетании с недостатком белка OGG1 – повышенный онкогенез у нокаутных мышей |
ogg1 (oxoguaninglycosilase 1 – оксогуанингликозилаза 1) | Онкогенез пищеварительной и дыхательной систем при генотоксическом стрессе |
Ung (uracil-DNA N-glycosilase – урацил-ДНК N-гликозилаза) | Усиление спонтанного апоптоза при дефиците белка UNG в клетках гиппокампа крыс. Ишемия головного мозга крыс |
ape1 (AP-endonuclease I – АП-эндонуклеаза I) | При окислительном стрессе недостаток белка APE1 приводит к усилению спонтанного мутагенеза и повышенной заболеваемости раком |
Polβ (polymerase β – полимераза β) | Повышенный мутагенез при воздействии повреждающих агентов; в опухолях была обнаружена экспрессия мутантных вариантов полимеразы со сниженной точностью действия |
xrcc1 (X-ray cross-complementing protein 1 – рентгеновский взаимно дополняющий белок 1) | Косвенная связь с аутосомно-рецессивными спиноцеребеллярными атаксиями |
lig1 (ligase I – лигаза I) | Штамм фибробластов 46 BR |
Примечание: 46 BR – штамм фибробластов, выделенный у пациентов с различными видами иммунодефицита, например гипогаммаглобулинемией.