Репарация ошибок репликации

Исследования репарации ошибок репликации начались во 2-й половине 20 в. В период с 1970 до середины 1990-х гг. активно исследовались белки, входящие в состав системы репарации мисматчей: MutS, MutL, MutH, UvrD и др. В 1991 г. впервые сформулированы Амстердамские критерии, используемые для диагностирования наследственного неполипозного колоректального рака (hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome, HNPCC), также известного как синдром Линча. В начале 2000-х гг. удалось установить взаимосвязь между синдромом Линча и мутациями в генах зародышевой системы репарации ошибок репликации. Мутации в генах MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2 были обнаружены у значительной доли пациентов с синдромом Линча, а также у части пациентов с неустановленной генеалогией.

Некомплементарные пары нуклеотидов (мисматчи) чаще всего возникают в результате ошибок работы систем репликации. Включение некомплементарного нуклеотида приводит к таким мутациям, как трансверсии (замена пиримидинового основания на пуриновое и наоборот) и транзиции (пурин-пуриновые и пиримидин-пиримидиновые замены). Мисматч искажает вторичную структуру двойной спирали ДНК ввиду образования неканонических водородных связей, например за счёт кето-енольной таутомерии или образования хугстеновских (имидазольных) пар.

У прокариот ошибки репликации восстанавливаются с помощью комплекса ферментов MutS, MutL, MutH и др. Процесс репарации начинается с распознавания мисматча гомодимером белка MutS, который сканирует двойную спираль, идентифицируя мисматч по искажению остова ДНК. Используя аденозинтрифосфат (АТФ), MutS охватывает место повреждения и индуцирует изгиб ДНК на содержащем мисматч участке. При этом изменяется конформация как ДНК, так и белка. Образовавшийся комплекс белка MutS и ДНК, изменившей конформацию, приводит в действие белок MutL, который в свою очередь активирует белок MutH. Последний фермент производит инцизию (разрез) в остове повреждённой цепи ДНК. Образовавшийся свободный конец используется ферментом экзонуклеазой для того, чтобы вырезать олигонуклеотид между одноцепочечным разрывом и участком, содержащим мисматч, а также геликазой UrvD (MutU, Helicase II) для разрыва водородных связей между вырезаемой последовательностью и комплементарной цепью. Экзонуклеаза оставляет свободную 3’-гидроксильную группу, с которой репликативная ДНК-полимераза III с участием SSB-белков начинает синтезировать вырезанный олигонуклеотидный участок. Последним этапом репарации является лигирование бреши ДНК-лигазой.

Возможны различия протекания процесса на определённых стадиях, например в зависимости от положения разреза используются разные экзонуклеазы: если разрыв цепи с 5’-стороны, используется экзонуклеаза VII или RecJ; если с 3’-стороны, экзонуклеаза I, экзонуклеаза VII или экзонуклеаза X.

Особую роль играет такой фермент прокариот, как Dam-метилаза (DNA adenine methylase). Его функцией является метилирование аденина по положению N⁶ в составе последовательности 5’-GATC-3’ в обеих цепях. После репликации молекула ДНК является хемиметилированной (родительская цепь метилирована, а дочерняя – нет). За счёт этого система репарации может отличить, в какую из цепей оказался встроен неверный нуклеотид. Так, фермент MutH проявляет эндонуклеотическую активность только по отношению к неметилированной цепи.

В эукариотических клетках систему репарации мисматчей составляют белки, гомологичные прокариотическим, но более сложного строения. Функцию узнающего мисматч белка MutS в клетках человека выполняют два гетеродимера: MutSα, состоящий из MSH2 и MSH6, и MutSβ, получаемый объединением MSH2 и MSH3. Первый гетеродимерный фермент используется для узнавания одного или двух мисматчей, второй распознает повреждения структуры, вызванные большим числом некомплементарных пар. Человеческие белки MSH2, MSH3 и MSH6 (MutS homologs) не только выполняют ту же функцию, но и являются гомологами прокариотического белка MutS. Функцию белка MutL выполняет димер MutLα, состоящий из субъединиц человеческого MLH1 (MutL homologs), гомологичного прокариотическому белку MutL, и белка PMS2.

На данный момент не обнаружено структурных и функциональных гомологов MutH, однако при взаимодействии с белком PCNA (proliferating cells nuclear antigen) фермент MutLα проявляет эндонуклеазную активность и способен производить одноцепочечные разрывы на обеих цепях ДНК. При этом комплекс MutLα и PCNA является специфичным по отношению к дочерней цепи эндонуклеазы, т. к. PCNA, связанный с ДНК, асимметричен.

Функцию 5`-3`-экзонуклеазы выполняет эукариотическая экзонуклеаза I (EXO1). Эукариотическая 3`-5`-экзонуклеаза не была определена однозначно, но некоторые исследования демонстрируют наличие 3`-5`-экзонуклеазной активности у ДНК-полимеразы Polδ. Выявлена связь 3`-5`-экзонуклеазы MRE11 и системы репарации мисматчей. Функции ДНК-полимеразы III и SSB-белков выполняют репликативные ферменты и белки эукариот.

У части пациентов с наследственным неполипозным раком толстой кишки были обнаружены нетипичные опухоли других тканей и органов, предположительно связанные с нарушением работы системы репарации ошибок репликации.

Нетипичные опухоли у пациентов с наследственным неполипозным раком толстой кишки