Биолюминесцентные системы на основе целентеразина
Биолюминесце́нтные систе́мы на осно́ве целентерази́на, набор белков, небольших органических молекул и в ряде случаев ионов двухвалентных металлов, позволяющих некоторым видам морских организмов испускать свет. Ключевые компоненты: единый для всех люциферин (целентеразин) и различающиеся по структуре люциферазы. Ряд систем также может содержать целентеразинсвязывающий белок и различные флуоресцентные белки. Все известные целентеразинзависимые люциферазы являются монооксигеназами и катализируют одну и ту же реакцию окисления целентеразина кислородом. В некоторых случаях целентеразин является функциональной группой и объединён с ферментом, катализирующим его окисление, в единый фермент-субстратный комплекс – фотобелок. Биолюминесцентные системы на основе целентеразина хорошо изучены и нашли широкое применение в биотехнологии и медицинских исследованиях.
Целентеразин
Целентеразин выступает в качестве люциферина или функциональной группы фотобелков в биолюминесцентных системах самых разнообразных светящихся существ и содержится в тканях морских организмов, таксономически относящихся к 6 различным типам: стрекающих (Cnidaria), гребневиков (Ctenophora), моллюсков (Mollusca), членистоногих (Arthropoda), хордовых (Chordata) и щетинкочелюстных (Chaetognathа). Самые изученные – целентеразинзависимые биолюминесцентные системы кораллов рода Renilla, креветок семейства Oplophoridae и веслоногих ракообразных подкласса Copepoda.
В сравнительно небольших количествах целентеразин обнаружен в тканях некоторых несветящихся морских рыб и креветок. Поскольку путь биосинтеза целентеразина неизвестен, то вопрос о получении этого вещества использующими его живыми организмами в большинстве случаев остаётся открытым. Однако его наличие у различных несветящихся животных позволяет предположить, что некоторые из них могут получать целентеразин из пищи либо как единственный источник этого вещества, либо как добавку к целентеразину, синтезируемому в организме.
Подавляющее большинство известных видов биолюминесцентных организмов обитают в море, и большинство из изученных биолюминесцентных систем этих организмов используют в качестве субстрата целентеразин. К ним относятся группы мягких кораллов, веслоногих ракообразных, ракушковых ракообразных, головоногих моллюсков, сцифоидных медуз, десятиногих ракообразных и др.
Химическая формула целентеразина C26 H21 O3 N3 . Молекула имеет в своей основе 3 аминокислотных остатка: фенилаланин и два тирозина. В чистом виде вещество представляет собой кристаллы жёлтого цвета. В силу большой склонности к окислению кислородом целентеразин крайне нестабилен, особенно в водных растворах.
Люциферазы
Несмотря на то что столь таксономически удалённые друг от друга группы живых организмов используют одну и ту же молекулу в качестве субстрата в своих биолюминесцентных системах, клонированные из них люциферазы показали очень низкую степень гомологии между собой, что говорит о независимых путях возникновения и развития этих биолюминесцентных систем.
В то же время все известные на данный момент целентеразинзависимые люциферазы являются монооксигеназами и катализируют одну и ту же реакцию окисления целентеразина кислородом. Их можно разделить на две группы: истинные люциферазы, катализирующие типичную реакцию окисления люциферина кислородом, и фотопротеины – биолюминесцентные белки, представляющие собой стабильные фермент-субстратные комплексы.
Биолюминесцентная система кораллов Renilla
Кораллы рода Renilla, также известные как морские анютины глазки (англ. sea pansy), принадлежат к подклассу восьмилучевых кораллов (Octocorallia) класса коралловые полипы (Anthozoa) и способны испускать свет в ответ на раздражение. Наиболее известный представитель Renilla reniformis обитает в тёплых водах континентального шельфа Западного полушария.
В коралловом полипе биолюминесцентная система локализована в специальных клетках – фотоцитах, а биолюминесценция контролируется нервной системой (Cormier. 1978[1]). Биолюминесцентная система Renilla включает в себя люциферазу, целентеразин, целентеразинсвязывающий белок (coelenterazine-binding protein, CBP) и зелёный флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP) (Charbonneau. 1979; Ward. 1979). CBP защищает нековалентно связанный с ним целентеразин от неспецифического окисления кислородом (Stepanyuk. 2008) и позволяет контролировать время и яркость свечения животного. Регуляция доступности связанного с CBP целентеразина осуществляется с помощью ионов кальция. Присутствие в системе GFP позволяет сместить максимум люминесценции в более длинноволновую область спектра (с длины волны λmax = 480 нм до λmax = 509 нм) благодаря механизму ферстеровского резонансного переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET).
Люцифераза коралла Renilla reniformis (Renilla-luciferin 2-monooxygenase, Renilla luciferase, RLuc) клонирована в 1991 г. (Lorenz. 1991). Это белок с молекулярной массой 36 кДа, обладающий внутриклеточной локализацией. Температурный оптимум работы люциферазы RLuc 18–37 °C, рН-оптимум лежит в диапазоне 6–7, однако квантовый выход реакции довольно низкий (Matthews. 1977[2]).
Эксперименты показали, что RLuc in vitro способна окислять целентеразин с испусканием квантов света и без дополнительных белков. Однако присутствие GFP как in vitro, так и in vivo увеличивает квантовый выход реакции, а максимум люминесценции смещается с длины волны λmax = 480 нм до λmax = 509 нм благодаря FRET (Ward. 1979). Эффективность люминесцентной реакции ощутимо возрастала, если вместо целентеразина к люциферазе добавляли CBP (Coelenterazine-binding protein ... 2008).
Несмотря на монооксигеназную природу RLuc, показано её родство с белками семейства α/β гидролаз (Consensus guided mutagenesis ... 2006), что также подтверждается сходством пространственной структуры этих ферментов, которое гораздо выше, чем с другими целентеразинзависимыми люциферазами и фотобелками (All three Ca2+-binding loops ... 2005; Spatial structure ... 2013).
Люцифераза Renilla и инструменты анализа, созданные на её основе, широко используются в науке и медицине: в исследованиях вирусных инфекций, изучении стволовых клеток, высокопроизводительном скрининге лекарственных препаратов, изучении рака. Однако наиболее активно биолюминесцентные методы исследований на основе люциферазы Renilla создавались для биоимиджинга и исследований белок-белковых взаимодействий.
Биолюминесцентная система креветок семейства Oplophoridae
Креветки Oplophorus gracilirostris относятся к отряду десятиногие ракообразные (Decapoda) класса высшие раки (Malacostraca). Эти глубоководные креветки способны в ответ на стимуляцию производить светящуюся слизь с помощью секреторных органов в основании антенн и ног, также на ногах имеются фотофоры.
Считается, что Oplophorus gracilirostris используют светящийся секрет для защиты от хищников.
Молекулярная масса природной формы люциферазы Oplophorus gracilirostris – около 106 кДа (Secretional luciferase ... 2000). Белок является секретируемым, склонен к агрегации и потере активности в растворах с рН меньше 7, имеет максимум биолюминесценции 454 нм. Однако, по данным гель-электрофореза, этот белковый комплекс состоит из 4 субъединиц, 2 с массой 19 кДа и 2 с массой 35 кДа.
Последовательности этих белков клонированы в 2000 г. (Secretional luciferase ... 2000), но биолюминесцентная активность была показана только для субъединицы 19 кДа (Satoshi Inouye. 2007[3]). Данные экспериментов косвенно указывают на то, что субъединица с массой 35 кДа несёт функцию стабилизации каталитической субъединицы в природной люциферазе (Satoshi Inouye. 2007). Яркость свечения биолюминесцентной реакции с участием люциферазы Oplophorus gracilirostris подвержена значительному влиянию температуры, концентрации солей в реакционной смеси и её рН. Температурный оптимум биолюминесцентной реакции около 40 °C, рН-оптимум – примерно 9.
Широкая субстратная специфичность люциферазы Oplophorus gracilirostris (Satoshi Inouye. 1997[4]) позволяет подбирать химически модифицированные аналоги целентеразина для улучшения спектральных характеристик и яркости биолюминесцентной реакции. С помощью методов направленного и случайного мутагенеза из субъединицы с массой 19 кДа были получены сначала более стабильная форма этого белка, имеющего в 3 раза более высокую биолюминесцентную активность (Engineered luciferase reporter ... 2012), а затем уже из неё мутантная форма, названная NanoLuc (NLuc). Яркость свечения биолюминесцентной реакции NLuc в лизатах клеток НЕК293 с фуримазином, аналогом целентеразина, в 2,5 млн раз выше, чем у субъединицы дикого типа с массой 19 кДа при реакции с целентеразином в тех же условиях, и в 150 раз выше, чем у реакций светлячковой люциферазы и люциферазы Renilla в аналогичных условиях (Engineered luciferase reporter ... 2012).
Именно NLuc – мутантная форма люциферазы Oplophorus gracilirostris – нашла широчайшее применение в различных областях биологии и медицины. Малые размеры молекулы делают её незаменимой для исследований, в которых размер гена имеет критически важное значение, к примеру для исследований вирусов. Как и исходная люцифераза Oplophorus gracilirostris, NLuc является секретируемым белком, что в совокупности с яркостью делает её прекрасным инструментом для биоимиджинга и маркерным белком в составе химерных белков. Биолюминесцентные методы анализа, созданные на основе NLuc, используются для создания платформ высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов, в методах детекции опиоидов в крови и каннабиноидов в моче, в оптогенетических исследованиях.
Биолюминесцентная система веслоногих ракообразных подкласса Copepoda
Веслоногие ракообразные (копеподы, Copepoda) – один из крупнейших по числу видов подкласс ракообразных, его представители многочисленны и играют важную роль в морских пищевых цепях. Биолюминесцентные виды обнаружены в отрядах циклопы (Cyclopoida) и каланиды (Calanoida). К первому относится род Oncaea, а ко второму – множество родов способных к свечению животных, в том числе Metridia, Pleuromamma и Gaussia. Биолюминесцентные копеподы способны производить светящийся секрет с помощью желёз на конечностях или теле (Herring. 1978[5]).
Первыми были клонированы люциферазы видов Gaussia princeps (Bryan. 1999) и M. longa (Markova. 2004) GpLuc и MLuc соответственно. Это небольшие, размером около 20 кДа, секретируемые белки. Они содержат сигнальный пептид, необходимый для секреции, вариабельный N-концевой домен и консервативный C-концевой домен. Согласно данным экспериментов, вариабельный домен не имеет отношения непосредственно к биолюминесцентной функции фермента (Markova. 2012[6]). Однако отсутствие этого домена в рекомбинантном белке крайне негативно сказывается на кинетике люминесцентной реакции, что указывает на его стабилизирующую и/или регуляторную роль. Константный домен люцифераз копепод отвечает за биолюминесцентную функцию (Cloning and expression ... 2004; Satoshi Inouye. 2008[7]).
Люциферазы копепод являются секретируемыми белками, склонны к агрегации, имеют высокую биолюминесцентную активность и термостабильность (Two forms of secreted ... 2008[8]) – даже после кипячения в течение 1 ч одна из изоформ MLuc теряет всего 50 % своей активности (Markova. 2015[9]). Люциферин-люциферазная реакция копепод имеет очень быструю кинетику (Markova. 2012[10]).
Известны последовательности 28 люцифераз копепод, принадлежащих 12 различным видам, причём у некоторых видов копепод присутствует по нескольку генов, кодирующих 2–3 изоформы люциферазы.
Для решения различных проблем, возникающих при практическом применении люцифераз копепод, создано множество различных мутантных форм с улучшенными характеристиками: с пониженной кинетикой реакции (Directed molecular evolution ... 2013; Superluminescent variants ... 2011[11]), со спектром биолюминесценции, сдвинутым в более длинноволновую область, и большей яркостью (Superluminescent variants ... 2011; Sung Bae Kim. 2014[12]; 2013[13]). Клонирована самая маленькая на данный момент природная люцифераза – изоформа MLuc массой 16,5 кДа (Markova. 2015).
Люциферазы копепод и созданные на их основе инструменты анализа нашли применение в биомедицинских исследованиях. Разработано множество приложений для исследования инфекционных заболеваний, в том числе вызванных вирусами ВИЧ, гриппа, гепатитов C и B, грибами Candida albicans, простейшими токсоплазмами (Toxoplasma gondii). Методики, основанные на биолюминесцентной системе копепод, используются для исследований рака, проведения иммуноанализов и в биоимиджинге.
Примечания
Литература
- Matthews J. C. Purification and properties of Renilla reniformis luciferase / J. C. Matthews, Kazuo Hori, M. J. Cormier // Biochemistry. – 1977. – Vol. 16, № 1. – P. 85–91.
- Cormier M. J. Applications of Renilla bioluminescence: an introduction // Methods in Enzymology. – 1978. – Vol. 57. – P. 237–244.
- Herring P. J. The luminescence and photophores of euphausiid crustaceans / P. J. Herring, N. A. Locket // Journal of Zoology. – 1978. – Vol. 186, № 4. – P. 431–462.
- Charbonneau H. Ca2+-induced bioluminescence in Renilla reniformis. Purification and characterization of a calcium-triggered luciferin-binding protein / H. Charbonneau, M. J. Cormier // Journal of Biological Chemistry. – 1979. – Vol. 254, № 3. – P. 769–780.
- Ward W. W. An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein / W. W. Ward, M. J. Cormier // Journal of Biological Chemistry. – 1979. – Vol. 254, № 3. – P. 781–788.
- Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase / W. W. Lorenz, R. O. McCann, M. Longiaru, M. J. Cormier // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. – 1991. – Vol. 88, № 10. – P. 4438–4442.
- Satoshi Inouye. The use of Renilla luciferase, Oplophorus luciferase, and apoaequorin as bioluminescent reporter protein in the presence of coelenterazine analogues as substrate / Satoshi Inouye, Osamu Shimomura // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 1997. – Vol. 233, № 2. – P. 349–353.
- Secretional luciferase of the luminous shrimp Oplophorus gracilirostris: cDNA cloning of a novel imidazopyrazinone luciferase / Satoshi Inouye, Ken Watanabe, Hideshi Nakamura, Osamu Shimomura // FEBS Letters. – 2000. – Vol. 481, № 1. – P. 19–25.
- Satoshi Inouye. Overexpression, purification and characterization of the catalytic component of Oplophorus luciferase in the deep-sea shrimp, Oplophorus gracilirostris / Satoshi Inouye, Satoko Sasaki // Protein Expression and Purification. – 2007. – Vol. 56, № 2. – P. 261–268.
- Satoshi Inouye. Identification of two catalytic domains in a luciferase secreted by the copepod Gaussia princeps / Satoshi Inouye, Yuiko Sahara // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2008. – Vol. 365, № 1. – P. 96–101.
- Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa. A novel secreted bioluminescent reporter enzyme / S. V. Markova, S. Golz, L. A. Frank [et al. // Journal of Biological Chemistry. – 2004. – Vol. 279, № 5. – P. 3212–3217.]
- All three Ca2+-binding loops of photoproteins bind calcium ions: the crystal structures of calcium-loaded apo-aequorin and apo-obelin / Lu Deng, E. S. Vysotski, S. V. Markova [et al. // Protein Science. – 2005. – Vol. 14, № 3. – P. 663–675.]
- Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output / A. M. Loening, T. D. Fenn, A. M. Wu, S. S. Gambhir // Protein Engineering, Design and Selection. – 2006. – Vol. 19, № 9. – P. 391–400.
- Coelenterazine-binding protein of Renilla muelleri: cDNA cloning, overexpression, and characterization as a substrate of luciferase / M. S. Titushin, S. V. Markova, L. A. Frank [et al. // Photochemical & Photobiological Sciences. – 2008. – Vol. 7, № 2. – P. 189–196.]
- Crystal structure of coelenterazine-binding protein from Renilla muelleri at 1.7 A: why it is not a calcium-regulated photoprotein / G. A. Stepanyuk, Zhi-Jie Liu, S. S. Markova [et al.] // Photochemical & Photobiological Sciences. – 2008. – Vol. 7, № 4. – P. 442–447.
- Markova S. V. High-active truncated luciferase of copepod Metridia longa / S. V. Markova, L. P. Burakova, E. S. Vysotski // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2012. – № 1. – P. 98–103.
- Markova S. V. The smallest natural high-active luciferase: Cloning and characterization of novel 16.5-kDa luciferase from copepod Metridia longa / S. V. Markova, M. D. Larionova, L. P. Burakova // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2015. – № 1. – P. 77–82.
- Two forms of secreted and thermostable luciferases from the marine copepod crustacean, Metridia pacifica / Yasuhiro Takenaka, Hiromi Masuda, Atsushi Yamaguchi [et al.] // Gene. – 2008. – Vol. 425, № 1–2. – P. 28–35.
- Superluminescent variants of marine luciferases for bioassays / Sung Bae Kim, Hideyuki Suzuki, Moritoshi Sato, Hiroaki Tao // Analytical Chemistry. – 2011. – Vol. 83, № 22. – P. 8732–8740.
- Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate / M. P. Hall, J. Unch, B. F. Binkowski [et al. // ACS Chemical Biology. – 2012. – Vol. 7, № 11. – P. 1848–1857.]
- Directed molecular evolution reveals Gaussia luciferase variants with enhanced light output stability / M. H. Degeling, M. S. Bovenberg, G. K. Lewandrowski [et al. // Analytical Chemistry. – 2013. – Vol. 85, № 5. – P. 3006–3012.]
- Spatial structure of the novel light-sensitive photoprotein berovin from the ctenophore Beroe abyssicola in the Ca(2+)-loaded apoprotein conformation state / G. A. Stepanyuk, Zhi-Jie Liu, L. P. Burakova [et al. // Biochimica et Biophysica Acta. – 2013. – Vol. 1834, № 10. – P. 2139–2146.]
- Sung Bae Kim. Creation of Artificial Luciferases for Bioassays / Sung Bae Kim, Masaki Torimura, Hiroaki Tao // Bioconjugate Chemistry. – 2013. – Vol. 24 (12). – P. 2067–2075.
- Sung Bae Kim. Functional Artificial Luciferases as an Optical Readout for Bioassays / Sung Bae Kim, Hiroshi Izumi // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2014. – Vol. 448 (4). – P. 418–423.
